周韻嬌，王婧姝，梁 凡，楊麗娜，楊 恭,3

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；

2. 復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200240；

3. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，上海 200032

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，起病隱匿，多數(shù)患者在確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，死亡率高。近年的研究表明，卵巢腫瘤組織細(xì)胞外基質(zhì)高表達(dá)的轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)與卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［1］。已有的臨床數(shù)據(jù)顯示，Notch3在卵巢癌患者中的異常突變和過表達(dá)與患者的低生存率和不良預(yù)后密切相關(guān)［2-3］。本課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)，Notch3信號通路參與了卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［4］。結(jié)合肺癌、乳腺癌［5-6］等腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究，我們推測，TGF-β1可能通過激活Notch3信號通路，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

γ-分泌酶是Notch信號通路的分子開關(guān)。最近的研究報(bào)道，γ-分泌酶結(jié)構(gòu)蛋白中的早老蛋白presenilin 1受腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)的調(diào)控［7］。TRAF6是一種泛素連接酶，通過介導(dǎo)底物蛋白形成K63位多聚泛素鏈，參與多條信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤形成和轉(zhuǎn)移［8-9］。因此我們推測，TRAF6可能作為TGF-β1與Notch3信號通路的接頭蛋白發(fā)揮作用。為此，本研究將通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些假說。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

上皮性卵巢癌細(xì)胞系Hey A8和Hey由美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)細(xì)胞庫提供。

1.1.2 試劑與耗材

RPMI-1640、β-actin單克隆抗體、TRAF6抗體、HRP(辣根過氧化物酶)偶聯(lián)的二抗、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑均購自美國Sigma-Aldrich公司，胎牛血清、青鏈霉素購自美國Gibco公司，pSmad2/3、Notch3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Hes1抗體購自美國Santa Cruz公司，TGF-β1中和抗體購自美國Abcam公司，TRAF6多肽抑制劑購自美國Novus Biological公司，TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒購自美國eBioscience公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購自日本同仁化學(xué)研究所，rhTGF-β1購自美國Peprotech公司，(3,5-二氟苯乙?；?-L-丙氨?；?L-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)購自Selleck公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、PVDF膜購自美國Millipore公司，RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Beyotime Biotechnology公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司，96孔板、24孔板、6孔板和Transwell小室購自美國Costar公司。

1.1.3 儀器

酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司，電泳儀和電轉(zhuǎn)印槽購自美國Bio-Rad公司，化學(xué)發(fā)光成像分析儀購自美國Protein simple公司，倒置顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1濃度檢測

上皮性卵巢癌細(xì)胞系Hey A8和Hey以70%～75%密度接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/ mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度條件下培養(yǎng)，次日貼壁后更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別于0、12、24、48和72 h取細(xì)胞培養(yǎng)上清液1 mL，3 000 r/min 4 ℃離心10 min，﹣80 ℃保存待測。采用ELISA檢測培養(yǎng)上清液中的TGF-β1濃度，步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)胞處理

Hey A8和Hey細(xì)胞根據(jù)1.2.1的方法接種，次日貼壁后更換為1%低血清RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分為6組：① 500 ng/ mL TGF-β1中和抗體處理組(對照組)；② 10 ng/mL TGF-β1處理組；③50 μmol/L DAPT處理組；④ 10 ng/mL TGF-β1和50 μmol/L DAPT共同處理組；⑤ 50 μmol/L TRAF6多肽抑制劑處理組；⑥ 50 μmol/L TRAF6多肽抑制劑和10 ng/mL TGF-β1共同處理組。

1.2.3 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測

根據(jù)1.2.2的方法處理細(xì)胞，分別收集①～④組0、12、24和48 h的細(xì)胞樣品和⑤～⑥組48 h的細(xì)胞樣品，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量，取30 μg蛋白樣品上樣檢測。電泳前，所有蛋白樣品在100 ℃水浴5 min，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，恒壓轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4 ℃溫育過夜，用TBST洗滌3遍，隨后加入HRP偶聯(lián)的二抗，室溫溫育1 h，用TBST洗滌3遍，進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯色反應(yīng)，用Protein Simple化學(xué)發(fā)光成像分析儀曝光顯色。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.2.1的方法常規(guī)接種Hey A8和Hey細(xì)胞于96孔板，每組細(xì)胞接種6孔，并根據(jù)1.2.2的方法處理細(xì)胞，分別于0、6、12、24、36、48和72 h用CCK-8試劑盒檢測。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

Hey A8和Hey細(xì)胞根據(jù)1.2.1的方法以90%的密度接種于6孔板，每組細(xì)胞接種3孔，根據(jù)1.2.2的方法處理細(xì)胞，于36 h用200 μL移液頭在單層細(xì)胞上劃痕，采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌1次，再加入各處理因素，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 h，劃痕的0和12 h在倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并拍照。計(jì)算不同處理組的細(xì)胞遷移率，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

遷移率=(0 h劃痕距離-12 h劃痕距離)/0 h劃痕距離。

1.2.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將Matrigel基質(zhì)膠(50 μg/mL)與無血清RPMI-1640培養(yǎng)基以1∶5比例混合，取80 μL混合后的Matrigel基質(zhì)膠鋪于8 μm孔徑的Transwell小室內(nèi)，置于24孔板，37 ℃靜置6 h，確保Matrigel基質(zhì)膠充分凝固。根據(jù)1.2.2的方法處理細(xì)胞，收集處理48 h的細(xì)胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整各組細(xì)胞濃度為2.5×105個(gè)/ mL，取200 μL細(xì)胞懸液加入上室，下室加入600 μL的1%低血清RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后取出小室。經(jīng)PBS洗滌、甲醇固定、結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以穿過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞的侵襲能力，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1濃度隨時(shí)間的變化

本研究采用ELISA法檢測Hey A8和Hey細(xì)胞在自然生長情況下分泌的TGF-β1水平。結(jié)果顯示，在12 h時(shí)，Hey A8和Hey細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TGF-β1濃度較0 h明顯增加，分別為(143.08±46.95)pg/mL和(216.30±22.21)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并且隨時(shí)間延長濃度明顯增加，72 h分別達(dá)到(311.22±22.02) pg/mL和(1 229.24±143.47) pg/ mL(圖1)。

因此，為了排除細(xì)胞自然生長過程中分泌的TGF-β1對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，后續(xù)研究以經(jīng)500 ng/ mL TGF-β1中和抗體處理的細(xì)胞作為對照。

2.2 TGF-β1通過激活Notch3信號通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖

本研究采用Western blot檢測了經(jīng)TGF-β1處理的上皮性卵巢癌細(xì)胞系Hey A8和Hey中TGF-β1通路分子pSmad2/3、Notch3受體蛋白細(xì)胞內(nèi)段(Notch3-ICD)及其下游基因Hes1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，Notch3-ICD和下游靶基因Hes1自24 h表達(dá)明顯增加，表明TGF-β1激活了Notch3信號通路(圖2A)。

同時(shí)，本研究采用CCK-8檢測了TGF-β1對卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，TGF-β1明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。

為了分析TGF-β1是否通過激活Notch3信號通路來促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖，本研究使用Notch3抑制劑DAPT和TGF-β1共同處理卵巢癌細(xì)胞。Western blot檢測結(jié)果顯示，50 μmol/L的DAPT不僅能夠有效抑制Notch3信號通路(圖2B)，而且也抑制了TGF-β1對Notch3信號通路的激活作用(圖2C)；CCK-8檢測結(jié)果也顯示，抑制Notch3信號通路能夠削弱TGF-β1對卵巢癌細(xì)胞的促增殖能力(圖2D)。由此推測，TGF-β1可能通過激活Notch3信號通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。

圖 1 ELISA法檢測Hey A8和Hey細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1濃度隨時(shí)間的變化Fig. 1 Concentrations of TGF-β1 in supernatants of cell culture medium from Hey A8 and Hey cell lines were measured by ELISA

圖 2 不同處理組Hey A8和Hey細(xì)胞中Notch3信號通路分子表達(dá)水平和細(xì)胞增殖能力的變化Fig. 2 Alterations of Notch3 pathway molecules and cell proliferation in different groups of Hey A8 and Hey cell lines

2.3 Notch3信號通路活化促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲

為了檢測被TGF-β1激活的Notch3信號通路對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，本研究采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室檢測卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，對照組、10 ng/mL TGF-β1處理組、50 μmol/L DAPT處理組、10 ng/mL TGF-β1和50 μmol/L DAPT共同處理組，Hey A8細(xì)胞遷移率分別為(39.93±5.31)%、(68.92±13.92)%、(24.28±12.16)%和(37.10±17.46)%，穿孔細(xì)胞數(shù)分別為(126±7)個(gè)、(186±19)個(gè)、(18±13)個(gè)和(84±8)個(gè)，Hey細(xì)胞遷移率分別為(38.11±5.22)%、(54.83±0.70)%、(33.73±4.44)%和(34.64±2.26)%，穿孔細(xì)胞數(shù)分別為(52±11)個(gè)、(170±16)個(gè)、(35±5)個(gè)和(111±12)個(gè)。該結(jié)果表明，與對照組相比，TGF-β1處理的Hey A8和Hey細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Notch3抑制劑DAPT能夠抑制TGF-β1對卵巢癌細(xì)胞的促遷移和侵襲能力(圖3A、3B)。由此可見，被TGF-β1激活的Notch3信號通路能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并且在促遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要的作用。

2.4 TRAF6介導(dǎo)TGF-β1對Notch3信號通路的活化

TRAF6作為一個(gè)泛素連接酶，有研究報(bào)道其參與了TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為此，本研究檢測了TGF-β1激活Notch3信號通路過程中TRAF6表達(dá)水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，TGF-β1上調(diào)Notch3-ICD蛋白表達(dá)的同時(shí)，TRAF6表達(dá)增加(圖4A)。為了進(jìn)一步分析Notch3信號的激活是否由TRAF6介導(dǎo)，我們又采用了50 μmol/L的TRAF6多肽抑制劑特異性抑制TRAF6的表達(dá)，觀察TGF-β1對Notch3信號通路活化情況的影響。結(jié)果顯示，抑制TRAF6蛋白的表達(dá)阻斷了TGF-β1對Notch3信號通路的激活作用。由此可見，TRAF6可能介導(dǎo)了TGF-β1對Notch3信號通路的激活作用。

3 討 論

卵巢癌的侵襲與轉(zhuǎn)移是腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因。TGF-β1通過與多條信號通路的相互作用，促進(jìn)腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移已被廣泛認(rèn)可［10］，卵巢癌也不例外［1］，但具體機(jī)制尚存在爭議。TGF-β1通過與細(xì)胞表面具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的受體相互作用，從而使內(nèi)源性Smad2和Smad3磷酸化，pSmad2/3與Smad4形成三聚體入核，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子后共同調(diào)控Snail、Slug等靶基因的轉(zhuǎn)錄［11-12］而實(shí)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本課題組的前期研究表明，Notch3的活化促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［4］。已有的臨床數(shù)據(jù)顯示，Notch的4個(gè)分子亞型中，Notch3分子在卵巢癌中具有癌基因的作用［13］，其異常突變和過量擴(kuò)增與患者的低生存率和不良預(yù)后密切相關(guān)［2-3］。Notch分子是一個(gè)跨膜的受體蛋白，通過與相鄰或自體細(xì)胞分泌的配體結(jié)合啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)合配體后的Notch在腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶和γ-分泌酶的剪切作用下裂解為細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)片段，細(xì)胞內(nèi)段在γ-分泌酶的進(jìn)一步作用下，釋放細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain, Notch-ICD)并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，與轉(zhuǎn)錄因子CSL(CBF-1、suppressor of hairless、Lag-1)結(jié)合后共同調(diào)控Hes1等下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［14］。

越來越多的研究表明［6，15］，Notch3信號通路在TGF-β1促腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中，發(fā)揮重要的作用，但具體的機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1處理的Hey A8和Hey卵巢癌細(xì)胞，Notch3-ICD和Hes1表達(dá)增加，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)，說明Notch3信號通路被激活，并影響細(xì)胞的生物學(xué)行為；用Notch3抑制劑DAPT處理后，TGF-β1不再上調(diào)Notch3-ICD和Hes1的表達(dá)，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力被抑制，提示TGF-β1可能通過激活Notch3信號通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。該研究取得了與其他腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制相似的結(jié)果。

在調(diào)控TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的多種泛素連接酶(E3)分子中，TRAF6能夠與多種跨膜受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用，介導(dǎo)底物蛋白形成K63位多聚泛素鏈，參與NF-κB、Akt等信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤血管形成和轉(zhuǎn)移［8-9,16-17］。最近有研究報(bào)道，在組成γ-分泌酶的3種結(jié)構(gòu)蛋白中，早老蛋白presenilin 1的活性受TRAF6調(diào)控［7］。鑒于γ-分泌酶是Notch3信號通路的“分子開關(guān)”，有關(guān)TRAF6在TGF-β1與Notch3信號通路中的作用鮮見報(bào)道，因此本研究對TRAF6在TGF-β1激活Notch3信號通路過程中的表達(dá)水平做了進(jìn)一步的分析。結(jié)果顯示，TGF-β1激活Notch3信號通路的同時(shí)，上調(diào)了TRAF6的表達(dá)，經(jīng)TRAF6特異性抑制劑處理的卵巢癌細(xì)胞，TGF-β1對Notch3信號通路的激活作用被抑制。由此說明，TRAF6介導(dǎo)了TGF-β1對Notch3信號通路的激活，并且提示TRAF6可能在TGF-β1與Notch3信號通路中作為接頭分子發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，表明了TGF-β1通過激活Notch3信號通路，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，TRAF6可能作為TGF-β1與Notch3信號通路的接頭分子介導(dǎo)這一過程。進(jìn)一步研究TGF-β1、Notch3和TRAF6之間的作用機(jī)制，將為臨床尋找卵巢癌新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)，我們也將通過體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)和臨床組織標(biāo)本作進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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