鐘召兵，王 寧，孫紅華，楊夫會

（泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山東泰安 271000）

微生物氣溶膠可以借助空氣進(jìn)行擴散和傳輸，引發(fā)人類和動植物疾病的流行與傳播，如傳染病、過敏癥和中毒等[1]。畜禽中的許多重大烈性傳染病的傳播為氣源性傳播，其病原微生物形成氣溶膠后容易擴散，并且傳播距離遠(yuǎn)。如1981年口蹄疫病毒（FMDV）從法國布列塔尼通過空氣傳播到英格蘭南部，導(dǎo)致英格蘭口蹄疫暴發(fā)[2]；2001—2002年在美國由于氣載炭疽引起了人的大批死亡[3]；肺炎克雷波氏菌可通過空氣傳播等。大量研究證明，人們要重視環(huán)境氣溶膠的危害。

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens），又稱魏氏梭菌，屬于腐生性厭氧芽胞致病菌，是引起畜禽猝死癥、壞死性腸炎、腸毒血癥和氣性壞疽的主要致病菌[4]，在自然界中廣泛分布，可見于土壤、污水、飼料、糞便及人畜胃腸道內(nèi)，是一種條件性致病菌[5]。由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的羊產(chǎn)氣莢膜梭菌病，主要表現(xiàn)為毒血癥，包括羊猝狙、羊腸毒血癥和羔羊痢疾等[3]。近年來，該病在我國的發(fā)病數(shù)量逐年增多，流行特點也由點狀散發(fā)發(fā)展為片狀散發(fā)，給我國養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[6]。該病病死率高，且不同菌型的產(chǎn)氣莢膜梭菌?；旌细腥?，導(dǎo)致原先使用的抗生素和疫苗隨著時間的推移耐藥性增強，對畜群的保護(hù)率越來越低，產(chǎn)氣莢膜梭菌病的暴發(fā)呈上升趨勢[7]。

大量研究表明，空氣中的微生物及其代謝產(chǎn)物（內(nèi)毒素、氨和硫化氫等）是影響動物和人類健康的重要因素[8]。本研究應(yīng)用基因間重復(fù)序列 引 物PCR（Enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-based PCR，ERIC-PCR）方法，分析空氣中氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌基因表型及耐藥性，為指導(dǎo)規(guī)模羊場臨床合理使用抗生素，以及感染防控方案動態(tài)調(diào)整或修訂、監(jiān)測和控制耐藥產(chǎn)氣莢膜梭菌等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 被研究羊場

采樣地點為泰安市的6個規(guī)模羊場（表1）。試驗前使用VTTEK-32全自動細(xì)菌分析儀系統(tǒng)進(jìn)行重新鑒定，質(zhì)控菌株參考銅綠假單胞菌株ATCC27853，大腸埃希氏菌ATCC25922作為對照株。

表1 羊場情況

1.2 樣品采集

采用國際標(biāo)準(zhǔn)ANDERSEN-6級空氣微生物樣品收集器（遼寧市應(yīng)用技術(shù)研究所）。收集器置于羊舍中央，放置高度為1 m，空氣流量是28.3 L/min，以血-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基為采樣介質(zhì)，驅(qū)動時間根據(jù)不同衛(wèi)生條件設(shè)在1～5 min之間，2016—2017年在泰安市6個規(guī)模羊場分離氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌30株。

1.3 藥敏試驗

采用美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）推薦紙片擴散法（K-B法），選用以下抗生素藥敏紙片：氨芐青霉素、頭孢噻肟、先鋒霉素、諾氟沙星、阿米卡星、強力霉素、頭孢他啶、青霉素和慶大霉素。結(jié)果判定及質(zhì)量控制按2010年CLSI標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行（表2）。

表2 抗生素耐藥標(biāo)準(zhǔn)

1.4 同源性檢測

1.4.1細(xì)菌總DNA提取 細(xì)菌DNA提取按細(xì)菌基因組提取試劑盒操作說明書進(jìn)行，提取后的產(chǎn)物于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2引物序列 ERIC1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′[10]。所有引物由上海生工生物有限公司合成。

1.4.3ERIC-PCR反 應(yīng) 體 系 10×PCR buffer（Mg2+free ）2.5 μL，MgCl2（2.5 mmol/L）2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.5 μL，上下游引物（25 μmol/L）各 1 μL，模板 DNA 2 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，滅菌雙蒸水補足25 μL。PCR基本反應(yīng)程序為預(yù)變性 95 ℃ 4 min、94 ℃ 30 s、36 ℃ 1 min、68 ℃ 8 min、10個循環(huán)，變性溫度上升到48 ℃、52 ℃分別設(shè)為15和10個循環(huán)，最后于68 ℃延伸16 min。瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色成像。

1.4.4數(shù)據(jù)處理 每個樣品的擴增帶存在時賦值為“1”，不存在時賦值為“0”，用電泳圖像分析軟件（Gel image system，Version 4.00）自動生成矩陣圖。采用非加權(quán)對數(shù)算術(shù)平均法（Unweighted pair group method using averages algorithm，UPGMA），利用NTSYS-pc 2.10軟件構(gòu)建聚類樹狀圖。另外，每個分離株看作是一個分類學(xué)單位（Operational taxonomic unit，OUT），并且把相似性≥90%的菌株看作起源相同的菌株[11]。為了減少誤差，所有菌株在同一個反應(yīng)條件下一次完成，而且電泳也是在相同凝膠中一次完成。

2 結(jié)果

2.1 分離株對常用藥物的敏感性

參照《中華人民共和國獸藥典》選取9種針對革蘭氏陽性厭氧菌的藥物分別對分離的氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行藥敏試驗，其中對慶大霉素的耐藥性最強，耐藥率達(dá)到了86.7%，其次為青霉素，耐藥率為43.3%，再次為強力霉素（36.7%）、頭孢他啶（30%）和阿米卡星（23.3%），對其他藥物耐藥率為1.0%～16.7%（表3）。

表3 30株氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌對抗菌藥物的耐藥性

2.2 ERIC-PCR分型

30株氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌株的ERIC-PCR指紋圖譜的條帶數(shù)為3～12，片段大小在0.1～4.5 kb之間。以相似系數(shù)0.8為分界線，30株氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌可以分為14個基因型，分別描述為Ⅰ、Ⅱ…XIII和XIV型，其中V型最多，有8株，占總菌株的26.7%。A9、A12、A13、A14、A15、B22和 B30菌株各自單獨成為1個型。所有氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株均具有大小約為1 000 bp的特異性條帶，最遠(yuǎn)親緣關(guān)系為70.0%，B26與B27號菌株親緣關(guān)系最近（圖1）。

圖1 30株氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌的ERIC-PCR聚類圖

3 討論與結(jié)論

抗生素在畜禽養(yǎng)殖上的應(yīng)用，對治療和預(yù)防動物疫病、促進(jìn)生長和提高畜牧業(yè)生長效能等方面都起到了積極作用。但是，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性變得越來越嚴(yán)重。細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)，與菌株長期處于多種抗生素選擇壓的環(huán)境中，其耐藥基因通過染色體或耐藥質(zhì)粒在菌群間廣泛傳播或擴散有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，30株臨床分離的氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥率高，對慶大霉素幾乎耐藥，對青霉素耐藥率達(dá)43.3%。耐藥性較高的抗生素是獸醫(yī)臨床使用頻率較高的藥物，原因是養(yǎng)殖場過量使用抗生素或規(guī)模化養(yǎng)殖場飼料中長期添加抗生素或促生長劑。因此，本試驗的藥敏數(shù)據(jù)為本地區(qū)用藥提供了一定參考，對建立和完善抗菌藥物臨床應(yīng)用和細(xì)菌耐藥預(yù)警機制具有重要意義。

臨床分離菌株的基因同源性分析對于流行病學(xué)調(diào)查，特別是傳染源和傳播途徑的追蹤具有重要意義。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一系列的分子生物學(xué)分型方法，其中細(xì)菌基因間重復(fù)共有序列PCR（Enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR，ERIC-PCR）分型技術(shù)是以腸桿菌科基因重復(fù)序列為引物進(jìn)行PCR，能擴增出多態(tài)性DNA圖譜[12]。DNA條帶特征能反映出細(xì)菌整個基因組結(jié)構(gòu)的差異，能區(qū)別含有ERIC重復(fù)序列的不同菌種或株，因此具有很強的鑒別種乃至菌株的能力。ERIC-PCR作為行之有效的分子分型技術(shù)，是一種被廣泛應(yīng)用的分子流行性病學(xué)調(diào)查方法，有利于快速判斷出地區(qū)流行菌株及其傳播情況，從而為防控疫病提供重要參考[13]。

氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌間存在遺傳多樣性，不僅存在于同一個血清型的不同菌株之間，而且存在于大量不可分型菌株之間。相對于血清學(xué)分型，ERIC-PCR技術(shù)對菌株的描述和比較的區(qū)分能力更高。本研究結(jié)果顯示，30株氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌ERIC-PCR指紋圖譜條帶數(shù)為3～12，片段大小在0.1～4.5 kb之間，可清晰分為14個基因型，大部分來源于不同的克隆株，其中Ⅴ型菌株數(shù)量最多，III型和Ⅵ型次之，表明氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌在本地區(qū)規(guī)模羊場內(nèi)存在感染和流行，導(dǎo)致克隆株在不同羊場及個體間相互傳播。

本研究發(fā)現(xiàn)部分菌株的同源性可達(dá)99%以上（菌株B26和B27），此兩株在場G-5中采集到，說明本研究所收集的氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌可能來源于同一克隆菌株，存在場內(nèi)克隆傳播，其耐藥譜特征也較為相似，但耐藥水平存在一定程度的差異，可能與該克隆株在不同感染個體所受到的抗生素選擇壓力的差異有關(guān)，使其能自行啟動外排泵等抗藥機制以適應(yīng)生存環(huán)境。同一個規(guī)模羊場的基因型也有不同，不同羊場之間也存在相同的基因型。

規(guī)模羊場氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌多重耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重，菌株之間存在很高的遺傳多樣性，克隆株在不同羊場及個體間相互傳播。不同環(huán)境和條件下同一種病原菌的基因型也存在一定差異，同一個規(guī)模羊場的基因型可有不同，不同羊場之間也可能存在相同的基因型。因此在規(guī)模養(yǎng)殖場內(nèi)，要密切關(guān)注氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌的監(jiān)測動態(tài)，防止場內(nèi)感染的進(jìn)一步流行和暴發(fā)，同時執(zhí)行嚴(yán)格場內(nèi)消毒制度。

[1] HO J，DUNCAN S. Estimating aerosol hazards from an anthrax letter[J]. Journal of aerosol science，2005，36（5/6）：701-719.

[2] DONALDSON A I，GLOSTER J，HARVEY L D，et al.Use of prediction models to forecast and analyse airborne spread during the foot-and-mouth disease outbreaks in Brittany，Jersey and the Isle of Wight in 1981 [J].Veterinary record，1982（110）：53-57.

[3] BERRY K，COLVIN S，BLYTHE D，et al. Follow-Up of Deaths Among U.S. Postal Service Workers Potentially Exposed to Bacillus anthracis—District of Columbia，2001—2002[J]. Morbidity & mortality weekly report，2003，52（39）：937.

[4] ANDERS J，ANNA A，KALDHUSDAL M，et al.Genetic diversity and prevalence of netB in Clostridium perfringens isolated from a broiler flock affected by mild necrotic enteritis[J]. Veterinary microbiology，2010（144）：87-92.

[5] AIKHALDI S F，VILLANUEVA D，CHIZHIKOV V. Identitication and characterization of Clostridium perfringens using single target DNA microarmy chip[J].International journal of food microbiology，2004，91（3）：289-296.

[6] 蔡寶祥. 家畜傳染病學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996.

[7] 張紅英，盧中華，楊霞，等. 我國魏氏梭菌病的流行特點[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2004，31（1）：39-41.

[8] PRAZMO Z，DUTKIEWICZ J，SKORSKA C，et al.Exposure to airborne gram-negative bacteria，dust，and endotoxin in paper factories[J]. Annals of agricultural and environmental medicine，2003（52）：937-938.

[9] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing：twentieth informational supplement M100-S20[S].Wayne：NCCLS，2010.

[10] GUIFANG W，LI P，HUIMIN D，et al. ERIC-PCR fingerprinting-based community DNA hybridization to pinpoint genome-specific fragements as molecular markers to identify and track populations common to healthy human guts[J]. Journal of microbiological methods，2010（59）：91-108.

[11] YUAN W，CHAI T J，MIAO Z M，et al. ERIC-PCR identification of the spread of airborne Escherichia coli in pig houses[J]. Science of the total environment，2010（408）：1446-1450.

[12] FITTIPALDI M，NOCKER A，CODONY F. Progress in understanding preferential detection of live cells using viability dyes in combination with DNA amplification[J].Microbiology methods，2012，91（2）：276-289.

[13] MARTAIN G T，SMYTH J A. Prevalence of netB among some clinical isolates of Clostridium perfringens from animals in the United States[J]. Veterinary microbiology，2009（136）：202-205.