趙麗青，王 勇，黃小華，張曉良，劉恩德，胡 煒，孫 宇，吳振興，賈俊濤，李正義

（1.山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山東青島 266002；2.貴州出入境檢驗檢疫局，貴州貴陽 550000）

弧菌是海洋環(huán)境中最常見的細菌類型，維持著 正常的海洋生態(tài)環(huán)境。但有些弧菌對人類和海洋動物有害。1995年《美國臨床微生物手冊》（第六版）確定了弧菌中的致病菌有12種，其中最重要的是霍亂弧菌、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和創(chuàng)傷弧菌[1]。在烹飪不當或食物容器生熟不分時，致病性弧菌可引起胃腸炎、創(chuàng)傷感染和食物中毒等癥狀[2]，因此美國食品藥品管理局（FDA）、北歐食品分析委員會（NMKL）和我國衛(wèi)生部都制定了相應的檢測標準[3]。

近年來，副溶血弧菌引起的食物中毒比例較高，已成為沿海地區(qū)食物中毒的首要病原，其危害程度僅次于沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌[4]。副溶血弧菌的致病因子有溶血素、脂多糖、胞外蛋白酶、尿素酶及Ⅲ型分泌系統(tǒng)等[5-6]。在多種環(huán)境刺激下，如低溫（冷鏈食品）、高鹽（腌漬食品）、高溫、酸和堿等，副溶血弧菌處于損傷狀態(tài)，致病性會發(fā)生變化。如何有效監(jiān)測受損的致病性弧菌，尤其是副溶血弧菌在多種環(huán)境中的殘存狀態(tài)，以及評估消費者最終暴露于副溶血弧菌等致病菌的可能性，具有重要的指導意義。

穩(wěn)定同位素標記（Stable isotope probing，SIP）技術具有示蹤、指示和判斷的功能，其檢測快速，結果準確，是了解致病菌受損過程中蛋白質和核酸動態(tài)變化的重要手段之一[7]。SIP技術主要包括兩種不同的路線：一種稱為代謝標記法，是以同位素標記的氨基酸形式在培養(yǎng)時加入；另一種稱為化學標記法，是在蛋白質提取后，酶解前、中、后蛋白質的一些功能基團與含有穩(wěn)定同位素標記的試劑發(fā)生化學反應。前者一般采用含有重穩(wěn)定同位素型必須氨基酸的培養(yǎng)基對微生物進行培養(yǎng)，但是無論是采用微生物發(fā)酵法，還是有機化學合成穩(wěn)定同位素標記氨基酸的方法，其成本高，工藝復雜，相關報道較少；后者采用蛋白質提取，使蛋白質功能基團（如肽段）與穩(wěn)定同位素標記的試劑發(fā)生化學反應，雖然應用廣泛，但副反應多，工藝復雜[8-9]。

本文提供了一種15N穩(wěn)定性同位素標記副溶血弧菌培養(yǎng)基的方法。副溶血弧菌通過標記培養(yǎng)基進行多次轉接培養(yǎng)，將菌細胞中氮原子置換成穩(wěn)定同位素15N，再通過質譜法LC-MS/MS進行驗證。在富含15N的培養(yǎng)介質中，生長繁殖的細胞內，蛋白質被標記。培養(yǎng)結束后，將正常介質（14N）中生長繁殖的細胞和被15N標記的細胞混合，破碎細胞，通過選擇性親和分離、色譜分離等過程，提取相關蛋白質，進行消化酶解，使其成為肽段，最后進行質譜分析。來自兩個對比樣本的每一肽段在質譜圖中表現為對峰，峰的間距等于標記肽段中的15N原子數。通過比較質譜圖中同位素標記內標物的對峰強度，便可確定對照細胞體系中蛋白質表達水平的差異。由于兩個對比樣本測定是在同一分析過程下完成的，因此具有很高的準確性；同時內標質譜法的信噪比高，測定靈敏度也較高。在傳統(tǒng)的蛋白質研究中，質譜只能應用于蛋白質的鑒定，而不能用于定量分析。這是因為不同的蛋白質或多肽具有不同的離子化率，而用同位素標記差異質譜巧妙地解決了這個問題[10]，從而為以后的蛋白質組學研究打下基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株

副溶血弧菌ATCC17802，購自美國菌種保藏中心。

1.2 儀器和試劑

儀器：液相色譜系統(tǒng)（Thermo Scientific EasynLC 1000）， 質 譜 儀（Thermo Fisher Orbitrap Velos）。試劑：蛋白胨10 g/L，氯化鈉30 g/L，蒸餾水1 L，NH4Cl 2 g/L，葡萄糖10 g/L，KH2PO40.6 g/L，KH2PO40.9 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl 20 g/L。

1.3 副溶血弧菌15N穩(wěn)定同位素標記最優(yōu)培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基成分對副溶血弧菌的生長有顯著影響。不同成分及各成分的用量和配比，不僅影響副溶血弧菌的產量和質量，而且也是決定生產成本的關鍵因素。堿性蛋白胨水是培養(yǎng)弧菌的通用配方，但是蛋白胨為有機氮源，無法進行15N標記。優(yōu)化15N-副溶血弧菌培養(yǎng)基的制備，以15N-副溶血弧菌產量高、15N的投入成本低為原則。本研究在國標GB4789.7的基礎上，設計了正交試驗方法來優(yōu)化碳源和氮源的用量和比例。

選擇（NH4）2SO4、NH4Cl和尿素作為無機氮源，葡萄糖和乙酸鈉為碳源，其他培養(yǎng)基成分（KH2PO4、K2HPO4、MgSO4和NaCl）固定，設計了“五因素、四水平”正交試驗方案。

1.4 副溶血弧菌在15N穩(wěn)定同位素標記培養(yǎng)基上的培育

將副溶血弧菌ATCC17802接種到3%氯化鈉堿性蛋白胨水中進行第1次增菌，于36 ℃搖床條件下培養(yǎng)18 h；用接種環(huán)將第1次增菌的副溶血弧菌轉接10環(huán)到15N穩(wěn)定同位素標記培養(yǎng)基上，于36 ℃搖床條件下培養(yǎng)40 h；用接種環(huán)將第2次增菌的副溶血弧菌轉接3環(huán)到15N穩(wěn)定同位素標記培養(yǎng)基中，進行第3次增菌，于36 ℃搖床條件下培養(yǎng)36 h；用接種環(huán)將第3次中增菌的副溶血弧菌轉接2環(huán)到15N穩(wěn)定同位素標記培養(yǎng)基中進行第4次增菌，于36 ℃搖床條件下培養(yǎng)24 h。待上述培養(yǎng)達到所需菌量后，10 000 r/min離心5～10 min，收集第4次增菌的副溶血弧菌細胞。

使用15N穩(wěn)定同位素標記培養(yǎng)基，連續(xù)多次轉接培養(yǎng)副溶血弧菌。進行高豐度15N穩(wěn)定同位素標記副溶血弧菌的逐步富集培養(yǎng)，馴化出高豐度15N穩(wěn)定同位素標記副溶血弧菌。

1.5 蛋白提取

將收集的15N標記副溶血弧菌和堿性蛋白胨水培養(yǎng)的副溶血弧菌提白分別用PBS清洗1次，然后加入200 μL 8 mol/L尿素和蛋白酶抑制劑，冰浴超聲（3 s、3 s、1 min、25%）。4 ℃、10 000 g離心10 min，去沉淀；使用Bradford法對蛋白進行定量；將總蛋白定量后取5 μg，將其還原烷基化后加入胰蛋白酶酶解。

1.6 副溶血弧菌細胞中蛋白質氮原子標記效率的LC-MS/MS驗證

1.6.1操作 將酶解液10 000 r/min、4 ℃離心后取上清液，ZipTip脫鹽，經離心濃縮儀干燥后，用0.1%甲酸溶液復溶，高速離心后取上清液注入LC-MS/MS儀器分析。

1.6.2質譜條件 取制備好的樣品5 μL進行上樣，設備為Thermo Fisher Orbitrap Velos。反向高效液相色譜條件（流動相）為A：0.1% Formic acid in water，B：0.1% Formic acid in Acetonitrile；流速為400 nL/min。質譜檢測條件為軌道肼質譜儀Thermo fisher Orbitrap Velos

正離子掃描方式，一級質譜掃描范圍375～1 300 m/z，250 ms，MS1resolution 為 60 000，選擇一級圖譜最高的50個峰進行二級掃描，掃描范圍375～1 300 m/z，碰撞電壓35 CID（表1）。

表1 色譜梯度

2 結果

2.1 15N穩(wěn)定同位素最優(yōu)培養(yǎng)基

試驗計劃及結果見表2。對表2進行方差分析，結果列見表3；對表2進行因素指標分析，結果見圖1。

由表2分析可知，各因素對副溶血弧菌生長影響的次序由大到小為葡萄糖（4）＞NH4Cl（2）＞ 乙酸鈉（5）＞ 尿素（3）＞（NH4）2SO4（1）。由表3分析可知，葡萄糖對副溶血弧菌的產量有極顯著影響，其他因素影響不顯著。由圖1可知，本次正交試驗的優(yōu)化配方為（NH4）2SO4（3 g/L）、NH4Cl（2 g/L）和葡萄糖（10 g/L），不添加乙酸鈉和尿素，此條件下的副溶血弧菌產量最高。

15N穩(wěn)定同位素標記的（NH4）2SO4和NH4Cl價格十分昂貴?？紤]到經濟成本，采用NH4Cl為唯一氮源，濃度為2 g/L，最終副溶血弧菌15N穩(wěn)定同位素標記培養(yǎng)基配方為：NH4Cl（2 g/L）、葡萄糖（10 g/L）、KH2PO4（0.6 g/L）、KH2PO4（0.9 g/L）、MgSO4（0.2 g/L）和NaCl（20 g/L）。配方經過多次重復增菌試驗，產量穩(wěn)定。

2.2 標記效率LC-MS/MS驗證

副溶血弧菌通過該標記培養(yǎng)基進行多次轉接培養(yǎng)，菌細胞中氮原子置換成穩(wěn)定同位素15N，其中在質譜法特別是LC-MS/MS中，驗證相對容易且安全。該方法工藝簡單合理，培養(yǎng)基組分簡單，成本低，為工業(yè)化制備15N標記副溶血弧菌培養(yǎng)基提供了新的制備方法。

通過改變流動相A和流動相B的比例，優(yōu)化色譜分離條件。在優(yōu)化的LC-MS/MS條件下，最后得到副溶血弧菌ATCC17802 總蛋白的總離子色譜圖（圖2-A）。取1個15N穩(wěn)定同位素標記蛋白（Lipoic acid amine dehydrogenase）的一個肽段的一級色譜圖（圖2-B）。經過分子量計算驗證可以得出結論：該蛋白中的氮原子由14N置換成穩(wěn)定同位素15N，標記效率達到91.5%。

表2 副溶血弧菌正交試驗直觀分析

表3 副溶血弧菌正交試驗方差分析

圖1 副溶血弧菌正交試驗效應曲線

圖2 色譜圖

3 結論

本文研究了一種15N穩(wěn)定性同位素標記副溶血弧菌培養(yǎng)基的制備及其培育方法，所述培養(yǎng)基的配方是：NH4Cl（2 g/L）、葡萄糖（10 g/L）、KH2PO4（0.6 g/L）、KH2PO4（0.9 g/L）、MgSO4（0.2 g/L）、NaCl（20 g/L）、蒸餾水（1 L，pH 7.0～7.5）；氮源的氮原子采用15N進行標記。培育15N標記副溶血弧菌的方法為連續(xù)多次

轉接培養(yǎng)副溶血弧菌，LC-MS/MS驗證標記的副溶血弧菌細胞中蛋白質氮原子的標記效率，標記效率為91.5%。該工藝簡單合理，培養(yǎng)基組分簡單，成本低，為工業(yè)化制備15N標記副溶血弧菌培養(yǎng)基提供了新的制備方法。

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