齊安生，張秀娟，宮楓舉，張興進(jìn)，馬 喆，潘子豪，孫學(xué)強(qiáng)，

（1. 黑龍江省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江哈爾濱 150069；2. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；3. 青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心，山東青島 266114；4. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095）

1971年洛克菲勒大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教授Blobel提出了“信號(hào)假說(shuō)”（Signal hypothesis），用以解釋生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成后的去向問(wèn)題。隨后該假說(shuō)得到了證實(shí)并具有普遍意義，他因此獲得了1999年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?！靶盘?hào)假說(shuō)”認(rèn)為蛋白質(zhì)的合成在核糖體上進(jìn)行。信號(hào)肽（Signal peptide）是蛋白質(zhì)的一個(gè)片段，能夠引導(dǎo)核糖體并定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并將不斷合成的肽鏈穿過(guò)通道，隨后信號(hào)肽被切割下來(lái)，完整的蛋白被釋放進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外[1]。研究發(fā)現(xiàn)，一般情況下，新生蛋白通常在位于其N端信號(hào)肽的指引下到達(dá)細(xì)胞特定區(qū)域，并由其介導(dǎo)完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。

豬鏈球菌屬于鏈球菌屬，現(xiàn)在公認(rèn)的血清型有33個(gè)， 其 中2型（Streptococcus suis type 2，SS2）最為常見(jiàn)，也最重要[3]。大多數(shù)SS2分離株都能產(chǎn)生溶血素并分泌至細(xì)胞外。豬鏈球菌溶血素（Suilysin，SLY）屬巰基活化的溶細(xì)胞素家族（TACY）溶血素[4]，為單鏈多肽，N端70個(gè)殘基（1/8的分子量）可以被除去而不影響其溶紅細(xì)胞活性。通過(guò)對(duì)其基因序列的分析發(fā)現(xiàn)5′端約81 bp編碼的27個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列。該序列與SLY結(jié)構(gòu)蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

本試驗(yàn)以溶血素基因?yàn)橹饕芯繉?duì)象，探索了信號(hào)肽對(duì)溶血素在大腸桿菌中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

1 材料和方法

1.1 菌株、抗體、酶等

豬鏈球菌2型HA9801株、pET28a（+）質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α和Rosetta株：由本實(shí)驗(yàn)室保存；豬鏈球菌2型溶血素單克隆抗體：由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)金梅林教授饋贈(zèng)；Taq酶、限制酶：購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司；引物：由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；硝酸纖維素膜及電泳試劑等：Sigma公司產(chǎn)品；核酸膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、HRP-SPA、增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒：購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 基因克隆、合成及表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank公布序列DQ443530和生物信息學(xué)分析設(shè)計(jì)合成3條引物：

S1-F：GGAGCCATGGGAAAAAGTTCGCACTTGATT；

S2-F：GCTGCCATGGATTCCAAACAAGATATTAATCAGTA；

S-R：CGCAGGATCCTTACTCTATCACCTCATCCGCATAC

以豬鏈球菌2型HA9801株基因組為模板，分別以S1-F和S-R、 S2-F和S-R為引物對(duì)，經(jīng)53 ℃退火、72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增得到帶有信號(hào)肽的溶血素基因sly1和擴(kuò)增不帶有信號(hào)肽的溶血素基因sly2；將sly1和sly2雙酶切后分別定向克隆至原核表達(dá)載體pET28a（+），構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a/sly1和pET28a/sly2（圖1）。

圖1 pET28a/sly1和pET28a/sly2質(zhì)粒圖譜

pET28a/sly1和pET28a/sly2轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并在含有卡那霉素的LB瓊脂平板進(jìn)行篩選。經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序分析鑒定正確后，分別選1株陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化Rosetta表達(dá)宿主菌，并在卡那氯霉素雙抗性平板進(jìn)行篩選。

1.3 溶血素的誘導(dǎo)表達(dá)

重組表達(dá)載體pET28a/sly1和pET28a/sly2轉(zhuǎn)化Rosetta后，各挑選1株，分別命名為Rsly1和Rsly2，接種含有卡那氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，振蕩過(guò)夜后，按照2%體積接種50 mL含有卡那氯霉素雙抗性LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)4 h后，加入IPTG誘導(dǎo)3 h，然后12 000 r/min 4 ℃離心5 min，分別收集上清和菌體。設(shè)立未加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)的對(duì)照，并同步同方法處理。

對(duì)Rsly1和Rsly2的誘導(dǎo)培養(yǎng)物離心上清，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，取3 mL加入終濃度為10%的三氯醋酸（TCA）冰浴30 min，然后10 000 g 4 ℃離心15 min，棄上清，加入500 μL冷丙酮洗滌，10 000 g 4 ℃離心15 min，去掉上清，風(fēng)干5 min，然后加入32 μL 1×PBS充分溶解，沉淀后分別命名為rSLY1′和rSLY2′。將Rsly1和Rsly2的誘導(dǎo)培養(yǎng)菌體用1×PBS洗滌2次，最后用20 mL充分懸浮，取樣后超聲波破碎，12 000 g 4 ℃離心20 min，取上清用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，分別命名為rSLY1和rSLY2。未進(jìn)行誘導(dǎo)的Rsly1和Rsly2對(duì)照同步同方法處理。

1.4 天然野生型SLY的提取

參照陳國(guó)強(qiáng)[5]等方法，將過(guò)夜培養(yǎng)的豬鏈球菌2型HA9801株種子液，按照2%體積接種5L THB液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)約12 h后，離心收集上清，加入硫酸銨至終濃度達(dá)到50%飽和度，離心收集沉淀，用40 mL 20 mmol/L的Tris-HCl重懸沉淀，經(jīng)過(guò)透析脫鹽后，超濾濃縮為8 mL，分裝?20 ℃凍存，命名為SLY。

1.5 重組溶血素的溶血活性試驗(yàn)

將rSLY1和rSLY2用Thermo NanoDrop 2000測(cè)定總蛋白含量。參照Gottschalk等方法[12]，各取0.5 mL加入2.5 mol/L的二硫代蘇糖醇（DTT）至終濃度為5 mmol/L，室溫孵育30 min后，分別用0.5 mL PBS進(jìn)行倍比稀釋；加入0.5 mL 2%（V/V）的兔血紅細(xì)胞，同時(shí)設(shè)0.5 mL超純水陽(yáng)性對(duì)照和PBS陰性對(duì)照；顛倒混勻后，37 ℃靜置孵育1 h，然后6 000 g 離心5 min；分別取各樣本200 μL上清，用分光光度計(jì)測(cè)定A540。在PBS陰性對(duì)照不溶血，即A540約為0的條件下，以吸光值達(dá)到超純水陽(yáng)性對(duì)照的50%為1個(gè)溶血活性單位，計(jì)算各樣本的溶血活性單位。

1.6 固體培養(yǎng)的信號(hào)肽功能試驗(yàn)

將Rsly1和Rsly2移植至含有IPTG的卡那霉素氯霉素的8%綿羊血的瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察溶血結(jié)果。

1.7 液體培養(yǎng)的信號(hào)肽功能試驗(yàn)

按照常規(guī)方法制備5%的濃縮膠和12%分離膠；將樣本 SLY、rSLY1′、rSLY2′、rSLY1、rSLY2，分別按比例加入5×SDS-PAGE載樣緩沖液后煮沸6 min，10 000 r/min 4 ℃離心5 min，然后取各上樣10 μL進(jìn)行電泳。

采用半干法轉(zhuǎn)印至NC膜后，用5%的脫脂奶封閉過(guò)夜；將轉(zhuǎn)印膜在含20 μL SLY單抗的20 mL TBST中，37 ℃孵育1 h；然后用TBST洗滌2次，每次10 min；20 mL TBST+20 HRP-SPA 37 ℃作用1 h后，用TBST洗滌2次；用DAB顯色約30 s后終止反應(yīng)，晾干觀察。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

以豬鏈球菌2型HA9801株基因組為模板，擴(kuò)增獲得帶有信號(hào)肽序列的sly1（長(zhǎng)度約為1 500 bp）和不帶有信號(hào)肽序列的sly2（長(zhǎng)度約為1 400 bp）的豬鏈球菌2型溶血素基因。構(gòu)建的pET28a/sly1和pET28a/sly2，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定均正確。

圖2 Rsly1和Rsly2固體培養(yǎng)溶血活性

2.2 重組溶血素的溶血活性試驗(yàn)

用Thermo NanoDrop 2000測(cè)定制備的rSLY1和rSLY2的總蛋白含量分別為6.2和7.1 mg/mL。參照Gottschalk等方法，測(cè)定提取的HA9801天然野生型SLY溶血活性單位含量為212，rSLY1為212，rSLY2 為 214。

2.3 固體培養(yǎng)的信號(hào)肽功能試驗(yàn)

在含有IPTG的卡那霉素氯霉素的8%綿羊血的瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)Rsly1菌落周圍出現(xiàn)2～4 mm溶血環(huán)，Rsly2菌落周圍未見(jiàn)溶血環(huán)，證明重組溶血素在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，信號(hào)肽能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外并發(fā)生溶血現(xiàn)象。

2.4 液體培養(yǎng)的信號(hào)肽功能試驗(yàn)

分別對(duì)Rsly1和Rsly2的誘導(dǎo)和同步未誘導(dǎo)培養(yǎng)物的上清和菌體處理后，進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所有未誘導(dǎo)的上清和菌體中均沒(méi)有與SLY單抗雜交的條帶出現(xiàn)（圖3-A和圖3-B的1、5、3、7泳道）；Rsly1和Rsly2誘導(dǎo)后的菌體樣本均出現(xiàn)以56 kD為主的現(xiàn)梯形條帶（圖3-B的4、8泳道）；Rsly1誘導(dǎo)培養(yǎng)物上清（圖3-B的2泳道）與野生型SLY（圖3-B的9泳道）的分子量一致，出現(xiàn)約56 kD的雜交條帶；而Rsly2誘導(dǎo)培養(yǎng)物上清（圖3-B的6泳道）未出現(xiàn)任何雜交條帶。試驗(yàn)證明了在液體培養(yǎng)中，信號(hào)肽能夠引導(dǎo)表達(dá)的重組溶血素蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，而且Rsly1誘導(dǎo)培養(yǎng)物上清上清中的重組溶血素分子量與HA9801溶血素分子量一致，說(shuō)明重組蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外后其N端的信號(hào)肽已被剪切掉；同時(shí)不帶有信號(hào)肽的重組蛋白不能完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖3 Rsly1和Rsly2誘導(dǎo)菌體和上清中重組溶血素SDS-PAGE和Western-Blot

3 討論

SS2已經(jīng)成為危害養(yǎng)豬生產(chǎn)及人類健康的重要人獸共患病病原[6]。其耐藥性日益增強(qiáng)，因而免疫預(yù)防依然是防制豬鏈球菌病的重要措施。SS2毒力基因以及保護(hù)性抗原的研究報(bào)道日漸增多，莢膜多糖（CPS）、溶血素、MRP和EF等是其重要毒力因子已經(jīng)得到共識(shí)。

溶血素作為SS2分泌到細(xì)胞外的一種重要的外毒素，具有良好的免疫原性，相對(duì)與其他毒力因子屬于分泌型，因此也成為構(gòu)建弱毒株研究的主要缺失靶標(biāo)。倪艷秀[7]、王雅等[8]、吳煒等[9]分別報(bào)道了SS2溶血素缺失株的構(gòu)建，認(rèn)為其可引起毒力下降和對(duì)不同動(dòng)物致病性的下降；在諸多有關(guān)SS2溶血素的缺失株構(gòu)建和基因表達(dá)等研究報(bào)道中，有關(guān)其信號(hào)肽的報(bào)道較少，大多數(shù)研究以其結(jié)構(gòu)基因及功能為主。本試驗(yàn)構(gòu)建了信號(hào)肽缺失的溶血素表達(dá)載體，證實(shí)了缺失信號(hào)肽的重組溶血素不能在大腸桿菌細(xì)胞中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而為構(gòu)建SS2溶血素缺失弱毒株提供一種新的基因缺失設(shè)計(jì)思路。

信號(hào)肽在引導(dǎo)外源蛋白分泌過(guò)程中具有重要作用，而且沒(méi)有嚴(yán)格專一性，因而可利用信號(hào)序列分泌外源蛋白。目前研究采用的信號(hào)肽可分為自身信號(hào)肽和外源信號(hào)肽，常用的有大腸桿菌的外膜蛋白，如外膜蛋白OmpA 、OmpF、λ噬菌體受體LamB、熱穩(wěn)定腸毒素STⅡ等。研究表明，多種外源基因連接上信號(hào)肽后，在原核表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌、L型細(xì)菌、芽孢桿菌和乳酸桿菌中等，都得到了分泌表達(dá)[10]。外源蛋白在宿主菌如大腸桿菌中的表達(dá)形式多為細(xì)胞內(nèi)包涵體不溶性表達(dá)，少數(shù)為細(xì)胞外分泌表達(dá)。利用信號(hào)肽來(lái)引導(dǎo)外源蛋白定位分泌到細(xì)胞特定區(qū)間，可提高可溶性，避免因包涵體復(fù)性帶來(lái)的困難。在菌株、培養(yǎng)和發(fā)酵等逐漸成熟的條件下，構(gòu)建高效的表達(dá)載體以提高外源蛋白質(zhì)的表達(dá)量是降低工業(yè)化生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽對(duì)蛋白質(zhì)的定位有著非常重要的作用，使得信號(hào)肽的研究不僅具有重要的理論意義，而且也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[11]?；谛盘?hào)肽的功能對(duì)重組抗體分泌同樣具有重要作用，通過(guò)添加一段合適的信號(hào)肽序列來(lái)引導(dǎo)重組抗體的分泌，不僅可以提高分泌效率和簡(jiǎn)化下游的純化過(guò)程，而且對(duì)抗體的穩(wěn)定性和活性都有積極作用，當(dāng)然信號(hào)肽序列的選擇和優(yōu)化要根據(jù)不同的蛋白質(zhì)及表達(dá)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行[12]。

在本試驗(yàn)中，以溶血素為研究對(duì)象，所構(gòu)建的重組表達(dá)載體能夠在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)，重組蛋白非包涵體形式，溶血素信號(hào)肽能夠介導(dǎo)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，但是跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至大腸桿菌細(xì)胞外重組蛋白少于細(xì)胞內(nèi)積累的重組蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)效率相對(duì)不高。從Western-Blot圖譜上，絕大多數(shù)的重組蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)積累，但是根據(jù)誘導(dǎo)后的菌體處理方法可見(jiàn)并未形成包涵體，因此可進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)條件，如調(diào)節(jié)IPTG的濃度、誘導(dǎo)溫度、延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間等，在降低表達(dá)效率同時(shí)提高重組蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)然溶血素信號(hào)肽的N端多肽結(jié)構(gòu)域、疏水活性以及信號(hào)肽轉(zhuǎn)運(yùn)后的剪切機(jī)制還有待于進(jìn)一步的分析和研究；溶血素信號(hào)肽能否提高包涵體形式表達(dá)的外源蛋白可溶性、能否引導(dǎo)包涵體形式的外源蛋白進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、能否引導(dǎo)外源蛋白在真核宿主細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，也有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以溶血素基因?yàn)橹饕芯繉?duì)象，通過(guò)基因克隆構(gòu)建了帶有和不帶有信號(hào)肽序列的重組溶血素表達(dá)載體，將篩選的大腸桿菌陽(yáng)性克隆，在固體和液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以固體培養(yǎng)溶血現(xiàn)象的發(fā)生以及液體培養(yǎng)物的Western-Blot，證明缺失了信號(hào)肽的重組溶血素不能被跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外；同時(shí)帶有溶血素信號(hào)肽的重組溶血素能夠跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)大腸桿菌細(xì)胞外。本試驗(yàn)為豬鏈球菌2型基因缺失弱毒疫苗的研究、細(xì)菌信號(hào)肽以及基因工程重組蛋白的可溶性表達(dá)進(jìn)行了有益探索。

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