莊曉曉， 王 鈺， 李闊闊， 沈小瑞

(安徽大學 資源與環(huán)境工程學院， 合肥 230601)

紅曲霉是單子囊菌(Monascus)的腐生真菌，其代謝產(chǎn)物有色素[1]、抗生素、洛伐他汀[2]、麥角固醇和γ-氨基丁酸等。洛伐他汀(Lovastatin)是一種膽固醇合成抑制劑，由日本學者遠藤章林于1979年在紅色紅曲霉(Monascus.ruber)中發(fā)現(xiàn)。由于其獨特的療效，目前已被稱為最佳的血脂調(diào)節(jié)物[3]。但洛伐他汀的生產(chǎn)及應用被次級代謝產(chǎn)物桔霉素所限制。

桔霉素是由脂類代謝產(chǎn)生的，會對健康造成一系列短期或者長期的影響[4]。動物實驗證實桔霉素是一種神經(jīng)毒性的真菌毒素，可以使動物致死，并有致畸作用[5]。同時還會引起實驗動物的腎臟腫大、尿量增多、腎小管擴張和上皮細胞變性壞死等癥狀[6-7]。楊建等[8]通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基使桔霉素的含量降低到1051 mg/L。劉穎等[9]通過對不同來源的紅曲樣品分離純化，再結合固態(tài)發(fā)酵定向篩選，得到一株低產(chǎn)桔霉素菌株NW3-2該菌株桔霉素含量低于最低檢測限16.0 μg/kg。

微生物誘變育種包括物理誘變和化學誘變。紫外誘變作為物理誘變的一種，其誘變的機制是紫外輻射影響DNA中堿基的正常配對和雙鏈的解開，從而影響DNA的復制。復合誘變一般包括兩種或兩種以上的誘變劑的先后使用，同一種誘變劑的重復使用和兩種或多種誘變劑的同時使用。一般認為復合誘變具有協(xié)同作用，其效果會比單一誘變效果好。王軒等[10]以紫外誘變結合化學誘變的方法，使誘變菌株比原始菌株的桔霉素含量降低了90%以上。

本研究以N+離子束誘變后得到的高產(chǎn)洛伐他汀菌株為出發(fā)菌株，對其再進行紫外誘變，以期得到低產(chǎn)桔霉素且洛伐他汀產(chǎn)量相對高而穩(wěn)定的誘變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅曲霉M50-2由安徽大學資源與環(huán)境工程學院資源植物保護與利用研究組通過N+離子束誘變篩選及保存[13]。

1.1.2 主要試劑和儀器

洛伐他汀標準品：中國藥品生物制品檢定所；桔霉素標準品：上海源葉生物科技有限公司；其他化學試劑均為分析純。高效液相色譜儀：Waters；色譜柱：Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)；恒溫恒濕箱：寧波江南儀器廠；搖床：上海知楚儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：100 mL甘油，25 g蛋白胨，2 g NaNO3，2 g ZnSO4·7H2O，1 g MgSO4·7H2O，1 g K2HPO4，1000 mL蒸餾水。液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：100 mL甘油，20 mL玉米漿，10 g硝酸鈉，10 g乙酸鈉，5 g甲硫氨酸，5 g KH2PO4，2 g MgSO4·7H2O，1000 mL蒸餾水。MEA(麥芽提取物)培養(yǎng)基：20 g麥芽提取物，10 g蛋白胨，20 g葡萄糖，15 g瓊脂，1000 mL蒸餾水，pH 5.4。

1.2 方法

1.2.1 桔霉素含量測定

液相色譜條件：色譜柱Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)；熒光檢測器，激發(fā)波長331 nm，發(fā)射波長500 nm，流速1.0 mL/min；等度洗脫流動相比例：甲醇∶純水(磷酸調(diào)pH 4)=55∶45，進樣量20 μL，柱溫保持在28℃。

標準曲線：稱取1 mg標準品溶解于50 mL甲醇溶液中，配制成20 mg/L溶液。稀釋成濃度為2、4、6、8、10和12 mg/L標準液。

提取方法：2 mL發(fā)酵液，加入4 mL乙醇，60℃水浴1 h，冷卻后，8000 r/min 離心10 min，取上清液用0.22 μm有機微孔濾膜過濾。

1.2.2 洛伐他汀含量測定

液相色譜條件：色譜柱Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)；檢測波長238 nm，流速1.0 mL/min；梯度洗脫流動相比例：乙腈∶0.1%磷酸緩沖液(0～6 min, 60∶40；6～24 min, 60～95∶40～5;26～30 min, 95～60∶5～40)進樣量10 μL，柱溫保持在35℃。

標準曲線：稱取50 mg標準品溶解于10 mL乙腈溶液中，配制成5 mg/mL溶液。吸取2 mL溶液于10 mL容量瓶中，配制成濃度為1 mg/mL標準液，再稀釋成濃度為0.01、0.03、0.05、0.07和0.09 mg/mL標準液。

提取方法：2 mL發(fā)酵液，加入6 mL無水乙醇，500 W超聲20 min，70℃水浴2 h，冷卻后，8000 r/min 離心10 min，取上清液用0.22 μm有機微孔濾膜過濾。

1.2.3 紅曲霉紫外誘變

將紅曲霉接種于MEA培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)7 d。無菌水沖洗并收集孢子懸液于150 mL錐形瓶中，加入無菌玻璃珠，160 r/min，30℃，培養(yǎng)24 h。無菌脫脂棉過濾除去菌絲，孢子濃度稀釋到108個/mL。取5 mL孢子懸液于無菌培養(yǎng)皿中，調(diào)整紫外燈距培養(yǎng)皿距離為30 cm，開啟皿蓋，分別處理30、60、90、120和150 s。誘變后用移液器吸取0.2 mL懸液在紅光下涂布平板，避光培養(yǎng)7～8 d。

1.2.4 高產(chǎn)洛伐他汀低產(chǎn)桔霉素菌株篩選

統(tǒng)計不同誘變劑量下存活菌落，計算致死率。分別挑取單菌落于MEA培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)7 d。接種菌絲于種子液培養(yǎng)基，160 r/min，30℃培養(yǎng)7 d。將種子液按1∶20比例接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，160 r/min，30℃培養(yǎng)10 d。HPLC法檢測發(fā)酵產(chǎn)物中的桔霉素及洛伐他汀含量，篩選具低產(chǎn)桔霉素及高產(chǎn)洛伐他汀性狀菌株。通過連續(xù)傳代培養(yǎng)檢測其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 22統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x ± s) 表示。多組間比較采用方差分析; 均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P≤0. 05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同紫外線照射劑量對紅曲霉致死率的影響

計算孢子懸液在不同紫外線照射時間下的致死率如表1所示，隨著誘變時間的增加而上升，在150 s達到最大值94.5%。為了提高孢子的誘變率，一般采用較高的致死率，故紫外線照射時間為120～150 s。

2.2 誘變菌株桔霉素含量檢測

紫外誘變后的菌株，液態(tài)發(fā)酵后測定其發(fā)酵產(chǎn)物中桔霉素含量，又根據(jù)其生長情況，篩選得到條件較好的102株紅曲霉菌株，其桔霉素含量如圖1所示，誘變菌株與出發(fā)菌株相對比只有11.7%表現(xiàn)正突變。

表1 誘變劑量對存活率和致死率的影響

2.3 低產(chǎn)桔霉素菌株洛伐他汀的檢測

如圖1所示，篩選得到的102株誘變菌株中13株桔霉素含量較低，相對于起始菌株和其他誘變菌株表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，因此對其進行進一步的洛伐他汀檢測。結果如表2所示，M90-22，M90-24，M120-1，M120-32相對于其他菌株具有顯著性差異，雖然這4株菌株之間在統(tǒng)計學上沒有顯著差異，但是M120-1的洛伐他汀產(chǎn)量為0.338 mg/mL，是最高的，所以選擇M120-1為較優(yōu)誘變菌株。

圖 1 誘變菌株桔霉素產(chǎn)量

菌株Strains洛伐他汀產(chǎn)量Lovastatinproduction(mg/mL)M50-20405±0011aM90-150256±0019fgM90-160233±0020gM90-220329±0019bM90-240322±0014bM90-320270±0021efM120-10338±0012bM120-60307±0019bcdM120-80240±0017gM120-90291±0012cdeM120-320330±0015bM150-10314±0013bcM150-120332±0003ab

2.4 目的菌株遺傳穩(wěn)定性

將誘變菌株M120-1連續(xù)培養(yǎng)12代，檢測1、3、6、9和12代的發(fā)酵產(chǎn)物中的桔霉素和洛伐他汀產(chǎn)量，以檢測其桔霉素和洛伐他汀產(chǎn)量的遺傳穩(wěn)定性。結果如表3所示。第6、第9和第12代相對于第1和第3代桔霉素產(chǎn)量略有下降，但6代以后每組之間沒有表現(xiàn)出顯著性差異。子代相對于第1代洛伐他汀產(chǎn)量略有下降，但每組之間以及和一代對比沒有表現(xiàn)出顯著性差異，基本保持產(chǎn)量的穩(wěn)定性。說明該誘變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，可以進行后續(xù)的發(fā)酵實驗。

表3 桔霉素和洛伐他汀遺傳穩(wěn)定性

3 討論

在微生物育種領域，隨著一些相關基礎學科的發(fā)展，利用現(xiàn)代生物技術如基因工程等來獲得優(yōu)良菌株的研究日益增多，成了育種領域中的熱點，然而這類研究的實施卻需要對微生物遺傳背景和次級代謝途徑的深刻了解，但大多數(shù)時候我們并不了解。因此實際生活中應用的還是這些傳統(tǒng)的育種技術。

利用紫外輻照處理N+離子束誘變得到的高產(chǎn)洛伐他汀菌株，將該菌株進行液態(tài)發(fā)酵后，分別測定發(fā)酵產(chǎn)物中的桔霉素和洛伐他汀產(chǎn)量。實驗結果表明，隨著輻照時間的增加，致死率不斷升高，而正突變率先升高后有所降低，這與麻成金等[11]的研究結果一致，桔霉素的產(chǎn)量逐步減少，說明N+離子束和紫外誘變結合的復合誘變，對降低桔霉的產(chǎn)量有較明顯的效果，與此同時，洛伐他汀的產(chǎn)量也相對保持穩(wěn)定，篩選出的紅曲霉突變菌株M120-1，其液態(tài)發(fā)酵桔霉素產(chǎn)量僅為2.15 mg/L，降低顯著，而洛伐他汀產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比相對穩(wěn)定。周建波等[12]利用紫外誘變篩選出了高產(chǎn)紅曲色素菌株，李闊闊等[13]運用N+離子束獲得了一株高產(chǎn)洛伐他汀紅曲霉菌株，由此可見，N+離子束誘變和紫外誘變對于紅曲霉誘變育種是一種理想、高效的方法，對紅曲霉的發(fā)展和生產(chǎn)都起到了促進的作用，可以推廣使用。

李蕙蕙等[14]使用60Co輻照選育低產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)洛伐他汀紅曲霉株，王軒等[10]使用了紫外和硫酸二乙酯復合誘變選育低產(chǎn)桔霉素紅曲霉株，胡文效等[15]使用了紫外、LiCl和硫酸二乙酯復合誘變選育高產(chǎn)洛伐他汀低產(chǎn)桔霉素紅曲霉株，還有通過添加銨鹽等物質來研究其對色素及桔霉素的影響。而本實驗選擇紫外和N+離子束復合誘變，屬于物理誘變，與化學誘變相比，物理誘變的操作安全性較高、誘變效率較高、對人體及環(huán)境污染較低且更易操作。

而在其中，紫外線能夠作為物質被物質吸收，所以被廣泛作為微生物誘變劑，其作用機制最為確定的解釋是紫外線的輻射是DNA分子形成嘧啶二聚體[16]，阻礙堿基配對，并有可能引起突變或死亡[17]。而且，嘧啶二聚體如果形成，還會阻礙雙鏈解開，從而影響DNA的復制與轉錄。所以在N+離子束和紫外復合誘變下，桔霉素生成過程中的有關蛋白質或酶發(fā)生了變化或轉化過程中的中間產(chǎn)物發(fā)生了變化，從而影響了桔霉素的產(chǎn)量，從而我們可以從所有誘變菌株中篩選出低產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)洛伐他汀的誘變菌株。

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