董喬梅， 趙 麗， 滕永軍

(蘭州大學第一醫(yī)院中心實驗室， 蘭州 730000)

1983年Blaschuk等首次在山羊精液中分離得到一種熱穩(wěn)定、對胰島素敏感、促進細胞間黏附的糖蛋白，將其命名為clusterin(CLU)[1]，并且發(fā)現(xiàn)該蛋白的分子質量80 ku，等電點為3.6，還原條件下在凝膠中呈現(xiàn)40 ku的條帶。1984年，CLU具有不同等電點的蛋白形式被分離了出來[2]。通過Western blot檢測CLU在小鼠前列腺中的表達時發(fā)現(xiàn)，其可以呈現(xiàn)具有不同分子質量的條帶。當切除小鼠的前列腺抑制雄性激素分泌使得clusterin誘導表達時，CLU的蛋白表達譜會變得更加復雜[3]。這一結果進一步證實了CLU是一種具有多種蛋白形式復雜難以研究的蛋白。CLU的功能多樣，參與細胞內(nèi)外重要的生命活動。CLU功能的多樣性與其復雜的結構密切相關。本文就clusterin不同蛋白產(chǎn)物的結構、定位、產(chǎn)生機制、具有的功能以及參與的信號通路做一綜述。

1 clusterin的結構及蛋白產(chǎn)生機制

圖 1 sCLU及nCLU的剪切加工機制[6]Fig 1 The processing mechanism of sCLU and nCLU

編碼CLU的基因位于8p21，全長為1.9 kb，其有9個外顯子和8個內(nèi)含子。這個單拷貝的基因可以編碼不同的蛋白產(chǎn)物，具有不同的細胞定位，發(fā)揮不同的生物學功能，主要是分泌型(sCLU)及核型(nCLU)。目前了解比較清楚的是sCLU，在這里sCLU被定義為經(jīng)過完全加工和剪切，成熟并可以分泌到細胞外發(fā)揮功能的糖蛋白。在其加工成熟的過程中，首先從第一個AUG密碼子(由第2個外顯子編碼)翻譯形成包含449個氨基酸的前體蛋白，位于胞漿，分子質量為60 ku。其前21個氨基酸組成了分泌信號序列，指導蛋白進入內(nèi)質網(wǎng)，發(fā)生糖基化，然后進入高爾基體，在Arg205和Ser206間發(fā)生斷裂，形成α鏈和β鏈，通過5個二硫鍵相連。這樣就形成了成熟的分泌型CLU(sCLU)。在不同種屬以及同一種屬不同的組織中，CLU的糖基化修飾會發(fā)生一定程度的變異，經(jīng)完全糖基化修飾成熟的蛋白其分子質量在75～80 ku之間(未發(fā)生切割)。這種蛋白在物種間相對保守，在一定的刺激信號下可以分泌到細胞外間隙和體液中發(fā)揮一定的功能[4-5]。對nCLU的加工成熟機制，目前主要有兩種觀點，選擇性剪切加工機制及選擇性轉錄起始位點加工機制。選擇性剪切加工機制認為，nCLU是clusterin全長基因經(jīng)過選擇性剪切形成的。當clusterin的第2個外顯子發(fā)生選擇性的剪切，第1個外顯子和第3個外顯子(編碼第2個AUG密碼子)發(fā)生拼接后，從第2個AUG密碼子翻譯形成分子質量為49 ku的蛋白，其不具有內(nèi)質網(wǎng)導肽，不能指導蛋白進入內(nèi)置網(wǎng)發(fā)生糖基化以及α鏈和β鏈的斷裂，但是具有至少兩個核定位信號，可以由胞漿轉運至核，轉變?yōu)楹诵?nCLU)，發(fā)揮一定的生理功能[6](見圖1)。選擇性轉錄起始位點加工機制認為，nCLU是由全長mRNA的第2個AUG密碼子(位于第3個外顯子上)起始翻譯形成的，但是在加工過程中并不發(fā)生第2個外顯子的選擇性剪切。然而，選擇性的轉錄起始位點理論和選擇性的剪切加工機制一樣，都不能解釋nCLU為何能在如此短的時間內(nèi)產(chǎn)生。至此，科學家們又提出了一種選擇性的啟動子理論，認為CLU的不同蛋白產(chǎn)物可能是由于它們分別活化不同的啟動子，導致具有不同N端結構域的蛋白產(chǎn)物合成，而這一結構域決定了蛋白在細胞中的定位，從而決定了蛋白在細胞中功能的發(fā)揮。因此，科學家們預測，在不同的實驗條件，不同的細胞類型及組織環(huán)境中檢測CLU基因不同啟動子區(qū)域的活化，可能具有一定的意義[7]。然而在目前還缺乏實驗證據(jù)的情況下，許多研究者們認為，與其說nCLU是一種異構體，不如說nCLU是一種細胞核中的存在狀態(tài)。我們對sCLU的結構已有了粗略的了解，但是依然不知道nCLU的真實面目，甚至有學者懷疑nCLU的存在可能是實驗中產(chǎn)生的假象。通過免疫熒光或是激光共聚焦掃描顯微鏡檢測CLU在完整地經(jīng)過固定的細胞中的定位將對其定位了解非常重要[8]。

2 CLU的功能

CLU具有多種功能，甚至在相互對立的方面均發(fā)揮重要的作用，例如細胞的增殖、凋亡。雖然CLU的發(fā)現(xiàn)已有20多年的歷史，但是對它在細胞增殖凋亡中發(fā)揮的作用目前還不是非常清楚。最初的研究發(fā)現(xiàn)CLU與凋亡相關。Leger等[9]通過原位雜交發(fā)現(xiàn)，在小鼠退行性前列腺凋亡的上皮細胞中CLU高表達；隨后許多科學家發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生凋亡的多種器官組織中(包括心、腦、肺、肝、腎和視網(wǎng)膜等)，均存在CLU的高表達。CLU的上調(diào)表達似乎可以成為細胞發(fā)生凋亡的標志。然而，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，CLU具有抗凋亡作用，在包括前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中高表達，并且其高表達與腫瘤的侵襲轉移以及不良預后密切相關[10-11]。CLU到底在腫瘤中高表達還是低表達，到底是誘導細胞凋亡還是促進細胞增殖存在爭議，甚至在同一種腫瘤的研究中都會出現(xiàn)相反的結果。出現(xiàn)這些矛盾的結果可以有多種可能的解釋：由于CLU存在多種細胞組分中，具有多種存在形式，不同類型又具有不同的定位，發(fā)揮不同的功能。運用針對CLU不同表位的抗體，靶向CLU不同異構體的引物合成出的PCR產(chǎn)物，這些不同都會導致最終結果的差異，甚至出現(xiàn)截然相反的結果。此外對同一結果的不同解讀也可能是導致偏差，出現(xiàn)矛盾結果的其中一個原因。目前一般的看法是，分泌型clusterin(sCLU)在不同遺傳背景的腫瘤細胞中起著抗凋亡的作用，而核型clusterin(nCLU)誘導細胞凋亡。并且兩者的動態(tài)平衡在細胞的生命活動中扮演重要的角色。

2.1 分泌型CLU與細胞增殖、凋亡

由clusterin全長mRNA翻譯，經(jīng)糖基化修飾，具有α鏈和β鏈的sCLU，其表達發(fā)生變化與多種惡性腫瘤的發(fā)展密切相關。Saffer等[12]用特異性識別sCLU的抗體，通過免疫組化檢測到82%的淋巴瘤中sCLU表達升高，可能作為生物標志物用于淋巴瘤的診斷。此外，研究發(fā)現(xiàn)sCLU的高表達還會導致機體對放療以及紫杉醇、阿霉素、順鉑等化療藥物產(chǎn)生抗性。在腫瘤細胞中，sCLU促進細胞增殖、抑制凋亡、對化療藥物產(chǎn)生抗性作用的發(fā)揮是通過與受體結合，活化多種信號通路來實現(xiàn)的。例如sCLU通過與其受體maglin的結合，促進AKT的磷酸化，進而誘導Bad蛋白發(fā)生磷酸化，阻止細胞色素c從線粒體中向胞漿中的釋放，抑制細胞發(fā)生凋亡[13]。sCLU與受體的結合同樣可以促進MEK/ERK信號通路活化，而該通路的活化可以促進細胞增殖[14]。Zoubeidi等[15]的研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中sCLU的高表達可以促進IKB的降解，釋放NF-κB入核發(fā)揮轉錄因子的作用，從而促進細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，sCLU通過與活化的Bax的相互作用來抑制凋亡[16](見圖2)。

盡管如此，分泌型CLU的表達上調(diào)是否是腫瘤發(fā)生的共同特征，可以保護腫瘤細胞免于凋亡，仍然存在爭議。因為也有文獻報道指出，分泌型CLU在包括胰腺癌、前列腺癌、食管癌、成神經(jīng)細胞瘤、結腸直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中低表達[17-18]，對其原因還不是非常清楚。一種可能的解釋就是在癌變過程中發(fā)生染色體、基因、蛋白的異常改變。在結腸直腸癌中經(jīng)常出現(xiàn)clusterin所在八號染色體短臂的缺失，這似乎可以解釋其低表達的原因。

2.2 核型CLU與細胞增殖、凋亡

nCLU被定義為細胞核中的一種存在形式，是通過一定的方法在完整的細胞核中檢測到的clusterin蛋白，即使是微量的存在也將其定義為nCLU[11]。最早是1996年由Reddy等[19]提出的，他們的研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ可以誘導細胞中的CLU進入細胞核。此后的研究發(fā)現(xiàn)，多種刺激因子，如電離輻射、化療藥物、激素、細胞因子、熱休克或是細胞缺鈣的作用下均可以誘導細胞核中CLU蛋白的表達。2003年之后，許多文獻開始報道nCLU可能具有的功能，發(fā)現(xiàn)該蛋白可能抑制細胞的增殖，促進細胞的凋亡。Moretti等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，當CLU在細胞核內(nèi)的表達量升高時可以抑制細胞發(fā)生增殖和遷移。Leskov等[21]對乳腺癌細胞系MCF-7的研究中發(fā)現(xiàn)，在電離輻射的作用下，CLU由胞漿轉運至核，促進細胞凋亡。Scaltriti等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌細胞中細胞核內(nèi)CLU的高表達可以引起G2-M期的停滯，從而誘導細胞經(jīng)caspase倚賴的途徑發(fā)生凋亡。目前認為nCLU促凋亡功能的發(fā)揮是通過在細胞核中與ku70蛋白作用實現(xiàn)的，nCLU與ku70的結合，抑制ku70蛋白發(fā)揮DNA損傷修復的功能，最終抑制細胞的增殖，促進細胞的凋亡[16](見圖2)。

當然，由于不同的腫瘤存在異質性，nCLU抑制細胞的增殖，促進細胞的凋亡的結論也不是絕對的。我們實驗室在對食管癌的研究中發(fā)現(xiàn)nCLU在腫瘤組織及細胞系中高表達，對其可能的機制正在進一步的研究中。

圖2 sCLU及nCLU參與的信號網(wǎng)絡[16]

3 小結

雖然CLU發(fā)現(xiàn)至今已有20多年時間，關于該蛋白的文獻報道已有上千篇，但是對CLU的認識依然令人迷惑不解。CLU蛋白還沒有得到分離、純化和結晶，目前得到的CLU蛋白的結構只是通過計算機模擬出來的；clusterin單一拷貝的基因可以編碼多種蛋白產(chǎn)物，但是這些蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生機制還沒有得到充分的揭示；CLU蛋白參與許多重要的生命活動，這些功能的發(fā)揮與該蛋白在細胞中的不同定位密切相關，而在這方面目前也缺乏全面的認識。因此，對不同類型的CLU蛋白結構的認識，產(chǎn)生機制的闡明，表達調(diào)控機制的了解非常重要。CLU不同蛋白類型之間的動態(tài)平衡到底在不同類型的腫瘤中發(fā)揮怎樣的作用，是否可以用于腫瘤的診斷，預后以及作為治療的靶標都有待進一步的研究。

致謝：感謝中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院趙曉航研究員在本文寫作中給予的幫助。

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