朱萬龍, 侯東敏, 孫舒然, 王政昆

(云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 昆明 650500)

白色脂肪組織(white adipose tissue, WAT)被廣泛認(rèn)為儲(chǔ)存脂肪，而褐色脂肪組織高水平表達(dá)產(chǎn)熱基因，通過產(chǎn)熱可以抑制體重增加和多種新陳代謝疾病[1-6]。米色脂肪細(xì)胞，由于冷刺激或其他各種活化劑誘導(dǎo)產(chǎn)生于白色脂肪組織中[7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠中激活褐色和米色脂肪細(xì)胞活性，能夠有效減少包括肥胖在內(nèi)的代謝疾病[8]。對(duì)越來越多的調(diào)控褐色和米色脂肪細(xì)胞基因通路的識(shí)別，可為新陳代謝疾病提供了多種治療途徑[9-10]。

流式細(xì)胞術(shù)自20世紀(jì)60年代開始發(fā)展起來，主要應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究，例如細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)，是細(xì)胞與分子生物學(xué)、單克隆抗體技術(shù)、生物技術(shù)、熒光化學(xué)、激光技術(shù)、光電子物理、流體力學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等多學(xué)科領(lǐng)域共同發(fā)展的結(jié)晶[11-12]。它不僅能夠快速定量分析細(xì)胞群的物理化學(xué)特征，還能通過這些特征精確分選細(xì)胞，主要分為流式細(xì)胞分析和流式細(xì)胞分選兩部分[13]。20世紀(jì)80年代后期開始應(yīng)用于臨床，并通過對(duì)外周血CD4+T細(xì)胞的檢測(cè)來監(jiān)測(cè)HIV患者疾病的進(jìn)展，開啟了用于臨床醫(yī)學(xué)的新紀(jì)元?，F(xiàn)在，流式細(xì)胞術(shù)不僅能夠輔助多種疾病的判斷，還為生物學(xué)發(fā)展提供了新技術(shù)[14-16]。

流式細(xì)胞術(shù)自發(fā)展以來多應(yīng)用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液、細(xì)胞凋亡、細(xì)菌學(xué)，而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也多為小鼠等嚙齒類動(dòng)物。對(duì)于脂肪細(xì)胞的研究也多數(shù)集中于前體脂肪細(xì)胞的分化機(jī)制及特異性分子標(biāo)記物，而缺少流式細(xì)胞術(shù)對(duì)于成熟脂肪細(xì)胞的分析、分選[17]。脂肪組織中的褐色脂肪組織，其產(chǎn)熱的機(jī)制是通過線粒體內(nèi)膜上的解偶聯(lián)蛋白-1(UCP1)將脂肪酸氧化與ATP產(chǎn)生解偶聯(lián)，把能量直接以熱量的形式散失而不生成ATP，即通過解偶聯(lián)作用消耗脂肪產(chǎn)生的熱量。因此褐色脂肪是消耗能量的組織，激活褐色脂肪可增加能量支出，具有潛在抵抗肥胖的作用，從而備受關(guān)注。隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)在冷刺激下，白色脂肪組織中會(huì)產(chǎn)生一種“brown-like”米色脂肪細(xì)胞，這一變化稱為白色脂肪組織的“褐變”，這種細(xì)胞富含線粒體，且表達(dá)BAT特有產(chǎn)熱基因——UCP1[18]。中緬樹鼩屬于攀鼩目樹鼩科動(dòng)物，主要分布于南亞和東南亞，為東洋界特有的小型哺乳動(dòng)物，由于其與靈長(zhǎng)類動(dòng)物親緣關(guān)系較近，它的新陳代謝系統(tǒng)和解剖結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比犬、鼠等更接近于人類，且作為模式動(dòng)物成本低，廣泛用于神經(jīng)、內(nèi)分泌、病毒等方面的研究，具有十分廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景，所以，以樹鼩為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在生物醫(yī)學(xué)上可以作為人類代謝疾病的良好動(dòng)物模型[19]。本研究以中緬樹鼩為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，首次利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)冷馴化下樹鼩脂肪細(xì)胞進(jìn)行了分析、對(duì)比，研究是否在冷馴化條件下中緬樹鼩的WAT中會(huì)產(chǎn)生米色脂肪組織，為以樹鼩的基礎(chǔ)生理學(xué)提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

1.2 流式細(xì)胞樣品的制備

1)動(dòng)物斷頸處死后，分別取下樹鼩肩胛、耳后、腋下褐色脂肪組織，與腹部大網(wǎng)膜、腹股溝白色脂肪組織后泡在PBS中，將組織上附著的毛洗掉。

2)將組織置于2 mL的EP管中，加1 mL 0.25%不含EDTA的胰酶，用平剪將組織剪碎，約1 mm3大小，將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，胰酶補(bǔ)至4 mL，放入37℃水浴鍋中溫浴，每隔10 min搖晃1次，顯微鏡下觀察組織塊消化成單細(xì)胞的程度，共約1 h。觀察樣品是否黏稠，若樣品較為黏稠，1000 r/min離心10 min仍不能離下沉淀，則補(bǔ)PBS至10 mL離心，1500 r/min 10 min，棄上清。

3)沉淀用10 mL PBS重懸一下，將大的組織塊剔除，離心1000 r/min，10 min，棄上清，留少量PBS將松散的沉淀吹散，吸出至新的2 mL離心管中，血細(xì)胞經(jīng)過離心后貼壁較牢，因此可將血細(xì)胞剔除。重復(fù)用PBS洗1次。

4)4%預(yù)冷的多聚甲醛將細(xì)胞重懸，4℃固定過夜。

5) 固定過夜的細(xì)胞用移液槍重懸起來，剔除大的組織塊，離心1000 r/min，10 min，4℃，棄上清。

6) 沉淀用1 mL PBS重懸，離心， 1000 r/min，10 min，4℃，棄上清留沉淀。

7)加1 mL的含0.1%的Tween細(xì)胞打孔劑將細(xì)胞重懸，打孔30 min。

8)離心800 r/min，10 min，棄上清。用PBS洗一遍細(xì)胞。加50～100 μL的PBS混勻細(xì)胞，加入適量的UCP1一抗，室溫孵育40 min。

9)加PBS至1 mL混勻，離心800 r/min，10 min，加PBS洗1遍。

10)按1∶2000的比例加入二抗，避光，室溫孵育40 min。PBS洗1遍，加PBS至1 mL，準(zhǔn)備上機(jī)[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

白色脂肪組織和褐色脂肪組織中UCP1抗體陽性標(biāo)記均以百分?jǐn)?shù)表示，由流式細(xì)胞儀讀數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 脂肪細(xì)胞樣品制備技術(shù)探討

為順利制備中緬樹鼩脂肪細(xì)胞流式樣品，實(shí)驗(yàn)前選擇冷馴化中緬樹鼩為材料，選用具有UCP1表達(dá)的褐色脂肪細(xì)胞進(jìn)行樣本分析，并選取70%酒精和4%多聚甲醛2種固定劑，0.1%Triton-100、0.05%Tween等2種打孔劑進(jìn)行組合探討最佳方案。其中利用70%酒精進(jìn)行固定后，再用0.1%Triton-100或0.05%Tween進(jìn)行打孔后，染色效果不好(圖1)。而利用4%多聚甲醛進(jìn)行固定后，再用0.05%Tween進(jìn)行打孔發(fā)現(xiàn)，其染色效果較好，約有70.40%的細(xì)胞被染色，可以選定利用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，0.05%Tween進(jìn)行打孔，制作中緬樹鼩脂肪細(xì)胞流式樣本(圖2)。

圖1 70%酒精固定對(duì)細(xì)胞散射光的影響

A： 0.1%Triton -100 ; B：0.05%Tween

圖2 4%多聚甲醛固定對(duì)細(xì)胞散射光的影響

A： 0.1%Triton -100通透；B：0.05%Tween通透

2.2 白色脂肪細(xì)胞的流式分析

對(duì)照組中緬樹鼩腹部大網(wǎng)膜、腹股溝等“典型”WAT顯示出單一的R1群，且沒有UCP1表達(dá)(圖 3)。冷馴化4周后，中緬樹鼩腹部大網(wǎng)膜、腹股溝等“典型”WAT顯示出單一的R1群, 用UCP1抗體標(biāo)記后，有5.70%的細(xì)胞顯示為陽性，冷馴化使WAT中出現(xiàn)UCP1表達(dá)陽性的細(xì)胞群(圖 4)。冷馴化7周后，樹鼩腹部大網(wǎng)膜、腹股溝“典型”WAT中出現(xiàn)了新的細(xì)胞群R2群。其中R1群用UCP1抗體標(biāo)記后，有69.64%的細(xì)胞顯示為陽性。冷馴化使WAT R1中出現(xiàn)UCP1表達(dá)陽性的細(xì)胞群。冷馴化新生成的R2群用UCP1抗體標(biāo)記后，有95.28%的細(xì)胞顯示為陽性，冷馴化使WAT中出現(xiàn)UCP1表達(dá)陽性的細(xì)胞群(圖 5)。

2.3 褐色脂肪細(xì)胞的流式分析

冷馴化7周后，樹鼩肩胛、耳后、腋下BAT中R1群用UCP1抗體標(biāo)記后，有67.82%的細(xì)胞顯示為陽性。R2群用UCP1抗體標(biāo)記后，有94.99%的細(xì)胞顯示為陽性。這說明冷馴化增加了樹鼩BAT中UCP1的表達(dá)，BAT產(chǎn)熱活性增強(qiáng)(圖 6)。

圖3 冷馴化0 d中緬樹鼩WAT流式分析圖

圖4 冷馴化28 d中緬樹鼩WAT流式分析圖

圖5 冷馴化49 d中緬樹鼩WAT流式分析圖

圖6 冷馴化49d中緬樹鼩BAT流式分析圖

Fig 6 The flow cytometric analysis diagram of BAT during 49d cold acclimation inT.belangeri

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首次成功探索出了利用中緬樹鼩脂肪組織流式樣品的制作方法，首次利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)冷馴化下中緬樹鼩脂肪細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比分析。研究結(jié)果顯示：冷馴化28 d時(shí)中緬樹鼩腹部大網(wǎng)膜、腹股溝等“典型”WAT的單一R1群中有5.70%的細(xì)胞顯示為UCP1陽性(圖4)。至49 d時(shí)“典型”WAT中出現(xiàn)了新的細(xì)胞群R2群。其中R1群有69.64%的細(xì)胞顯示為UCP1陽性，R2有95.28%的細(xì)胞顯示為UCP1陽性。冷馴化使WAT中出現(xiàn)UCP1表達(dá)陽性的細(xì)胞群(圖5)，結(jié)合本研究組之前對(duì)于冷馴化條件下脂肪組織切片的形態(tài)學(xué)證據(jù)[21]，本研究得出冷馴化確實(shí)可以誘導(dǎo)出米色或褐色脂肪細(xì)胞。

但目前關(guān)于如何誘導(dǎo)白色脂肪組織中出現(xiàn)米色脂肪細(xì)胞的具體機(jī)制還不清楚。許多著名學(xué)者都對(duì)這一誘導(dǎo)機(jī)制產(chǎn)生了濃厚興趣，紛紛對(duì)此進(jìn)行了研究[22-24]。Tran等對(duì)小鼠的脂肪組織進(jìn)行電鏡切片，對(duì)可能產(chǎn)生米色脂肪細(xì)胞的組織進(jìn)行相關(guān)基因檢測(cè)，認(rèn)為米色脂肪細(xì)胞可能起源于血管內(nèi)皮細(xì)胞[25]。Barbatelli等將小鼠進(jìn)行冷暴露，發(fā)現(xiàn)冷馴化下的小鼠中的白色脂肪細(xì)胞的C/EBPα基因表達(dá)增加，而與細(xì)胞有絲分裂相關(guān)的基因則基本維持穩(wěn)定水平?jīng)]有改變，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)合出現(xiàn)米色脂肪組織的超顯微結(jié)構(gòu)的照片得出，冷馴化可以誘導(dǎo)WAT中出現(xiàn)米色脂肪細(xì)胞[26]。而Schulz的團(tuán)隊(duì)則利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行研究，他們分選出的前體骨骼肌細(xì)胞(Sca-1+, CD45, Mac1)，可以用藥物誘導(dǎo)分化成米色脂肪細(xì)胞[27]。目前的研究主要指向這3種不同的發(fā)生機(jī)制，但不能排除這3種機(jī)制共同作用，若有共同作用，何種作用為主導(dǎo)皆有待闡明。相信以BAT 為靶點(diǎn)，安全有效的誘導(dǎo) WAT中的米色脂肪細(xì)胞必將成為防治肥胖等代謝疾病研究的新方向[28-29]。

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