付家豪， 何一帆， 朱萬龍， 高文榮， 王政昆

(云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500)

哺乳動(dòng)物的被毛顏色作為其主要的表型之一，主要用來掩飾自己避免天敵的捕捉，而這種性狀的產(chǎn)生則是通過自身遺傳多樣性與環(huán)境因子共同作用導(dǎo)致的。有研究指出同一種或者同一種下的各亞種間的毛色都會(huì)產(chǎn)生一定的差異，例如方美英等對(duì)豬的毛色進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)豬的毛色類型分為白色、黑色和棕色等[1]。這種表性的差異可以歸結(jié)于“自然選擇”的結(jié)果，即物種長期生存在某一環(huán)境下往往會(huì)產(chǎn)生對(duì)周圍環(huán)境相對(duì)應(yīng)的改變，這種改變最終會(huì)被固定下來反應(yīng)在自身遺傳多樣性上。

動(dòng)物的毛色主要是由黑色素(melanin)決定的，一般存在于皮膚的表層和眼睛的葡萄膜中。黑色素可以分為兩種，一種叫真黑色素(eumelanin)，另一種叫偽黑色素(pheomelanin)，前者主要表現(xiàn)為黑色和褐色，而后者則主要表現(xiàn)為紅色和黃色，二者的分布及比例共同影響了動(dòng)物的毛色[2]。黑色素皮質(zhì)激素受體1基因(Melanocortin receptor 1，Mc1r)作為控制動(dòng)物毛色的主效基因[3]，已在哺乳動(dòng)物中得到驗(yàn)證[4-5]。它是一種最小的G蛋白偶聯(lián)受體，隸屬于G蛋白偶聯(lián)家族，含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，只有一個(gè)外顯子長度約為900多bp，編碼了310個(gè)左右的氨基酸，主要在黑色素細(xì)胞中表達(dá)造成色素沉積[6]。主要作用機(jī)制為：α-促黑色素皮質(zhì)激素和促腎上素皮質(zhì)激素作為Mc1r的配體與之結(jié)合，促使G蛋白二磷酸鳥苷活化為三磷酸鳥苷，激活腺苷酸活化酶通路生成環(huán)腺苷酸進(jìn)一步活化絡(luò)氨酸激酶促進(jìn)黑色素細(xì)胞體內(nèi)生成多巴，多巴聚集到一定程度釋放黑色素[7]。如果活化的絡(luò)氨酸酶過多，則多巴和多巴醌合成黑色素，倘若活化的絡(luò)氨酸酶處于少量狀態(tài)，則會(huì)出現(xiàn)偽黑色素[8]。

中緬樹鼩(Tupaiabelangeri)隸屬攀鼩目(Scandentia)樹鼩科(Tupaiidae)，為東洋界特有的一種小型哺乳動(dòng)物[9]。其主要分布在南亞、東南亞以及我國的西南地區(qū)和海南島，同樣也是分布于我國的唯一一種現(xiàn)生樹鼩。本研究旨在通過不同地理種群mc1r彼此間的序列差異及分子進(jìn)化來探討不同地理種群間的聚類關(guān)系，為以后研究中緬樹鼩毛色的遺傳機(jī)制提供一些基礎(chǔ)性材料。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物來源

實(shí)驗(yàn)所采用中緬樹鼩(Tupaiabelangeri)捕捉于我國云南省、四川省、廣西壯族自治區(qū)、貴州省以及海南省(表1)。捕捉后的動(dòng)物經(jīng)原地?cái)囝i處死，然后以干冰保存連夜送至云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物生理生態(tài)實(shí)驗(yàn)室，用于后續(xù)DNA提取。

表1 中緬樹鼩種群采樣地點(diǎn)及樣本數(shù)

1.2 DNA提取

取實(shí)驗(yàn)樣品腿部肌肉組織，采用美國OMEGA公司肌肉組織DNA提取試劑盒(Tissue DNA Kit D3396-01)提取DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)濃度后置于-20℃冰箱中保存。

1.3 MC1R基因擴(kuò)增與測序

經(jīng)NCBI查詢中緬樹鼩(Tupaiabelangri)黑色素皮質(zhì)激素1(MC1R)基因(GenBank登錄號(hào)：NW_006159850.1)CDS區(qū)堿基序列，設(shè)計(jì)引物覆蓋整個(gè)CDS區(qū)(表2)。PCR擴(kuò)增條件：94℃條件下預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火35 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

表2 Mc1r引物基本情況

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Seqmen軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得954 bp基因序列，經(jīng)BLAST比對(duì)確認(rèn)所測序列為目的基因；采用Mega軟件對(duì)112條序列進(jìn)行比對(duì)并計(jì)算堿基含量及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；采用Dnasp軟件計(jì)算單倍型及其在各地理種群中的分布并結(jié)合NetWork軟件繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖[10];通過I-TASSER在線服務(wù)[11-12](http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu)和TMHMM Server v.2.0 在線軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mc1r基因序列堿基組成

通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)共擴(kuò)增得到112個(gè)樣本954 bp堿基序列(圖1)，其中各堿基平均組成為(表1)：A(13.4%)、T(19.5%)、C(38.3%)和G(28.8%)。A+T(32.9%)比例明顯低于C+G(67.1%)，表現(xiàn)出程度較高的堿基含量偏倚性，G、C含量的過高，說明這段序列中富含氫鍵。另外一共在954 bp序列中檢測到930個(gè)保守位點(diǎn)(Conserved sites)，占總位點(diǎn)數(shù)的97.4%。另有24個(gè)變異位點(diǎn)(Variable sites)，占總位點(diǎn)數(shù)的2.6%。

2.2 生物信息學(xué)分析

954 bp基因序列一共編碼了317個(gè)20種常用氨基酸(表2)，其中亮氨酸(Leu)含量最高，占18.2%，含量最少的為色氨酸(Trp)，為0.9%。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，α-螺旋占了較大比例，其次是無規(guī)則卷曲(圖2)，并且含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3)。

圖1 PCR電泳結(jié)果(西昌種群)

種群Population胸腺嘧啶(T)胞嘧啶(C)腺嘌呤(A)鳥嘌呤(G)大理(DL)195384133288大新(DX)197381131290昆明(KM)195384135286海南(HN)195384132289河口(HK)195384134287樂業(yè)(LY)195384133288勐臘(ML)195383133288片馬(PM)197383133287西昌(XC)195384134287興義(XY)195384134288總計(jì)(Total)195383134288

表4 Mc1r基因序列氨基酸組成

圖2Mc1r翻譯的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

Fig 2 The secondary structure ofmc1rtranslated protein

圖3 Mc1r跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.3 單倍型分析及種群間遺傳距離

在本研究中112條mc1r序列共定義了13個(gè)單倍型，各單倍型在各地理種群中的分布如表3所示，其中有4個(gè)共享單倍型(H1、H2、H7、H9)占總單倍型數(shù)的30.7%。單倍型多樣性指數(shù)介于0.125(昆明種群)～ 0.764(興義種群)間，核苷酸多樣性指數(shù)介于0.00013(昆明種群)～ 0.00122(興義種群)間。10個(gè)地理種群MC1R基因種群間遺傳距離結(jié)果顯示(表4)，大新種群、海南種群和片馬種群與其他種群兩兩比較遺傳距離值較大，介于0.008 ～ 0.012間，遺傳距離最大的為海南種群與昆明種群。

2.4 MC1R基因序列飽和度檢驗(yàn)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

運(yùn)用DAMBE軟件對(duì)mc1r進(jìn)行序列飽和度檢驗(yàn)(Test of substitution saturation)(表5)，如果ISSISS.c，則不論差異是否顯著,均不適合構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[14-15]。在本研究中ISS數(shù)值明顯小于ISS.c，并且差異極顯著(P=0.0000)，表明這段序列未達(dá)到飽和狀態(tài)可以用來構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用13個(gè)單倍型基于Kimura 2-Parameter距離模型構(gòu)建ME系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果顯示10個(gè)地理種群的中緬樹鼩明顯分為四支，一支為海南種群(CladeⅠ)、一支為大新種群(CladeⅡ)、一支為片馬種群(Clade Ⅲ)、最后一支為其他種群(Clade Ⅳ)。

3 討論

在不同的生存環(huán)境中，物種為了適應(yīng)環(huán)境從而形成相差異的遺傳多樣性，而遺傳多樣性往往也是研究環(huán)境和生物之間關(guān)系的重要內(nèi)容[16]。中緬樹鼩生存環(huán)境的不同，其被毛顏色也往往也不相同，表現(xiàn)為表型差異性。根據(jù)達(dá)爾文“自然選擇”學(xué)說可把表型差異性歸結(jié)為物種對(duì)周圍生存環(huán)境長時(shí)間的適應(yīng)的結(jié)果，并固定下來，最終反映在相應(yīng)基因的遺傳多樣性上。于永梅等對(duì)野生型中緬樹鼩進(jìn)行表型毛色分析后發(fā)現(xiàn)，不同中緬樹鼩被毛顏色表型上存在差異，但關(guān)于這些差異的遺傳基礎(chǔ)依舊不明朗[17]。在本研究成功擴(kuò)增得到不同地理種群中緬樹鼩Mc1r基因CDS區(qū)954 bp序列，共計(jì)編碼317個(gè)氨基酸，其中各地理種群各氨基酸含量相差不顯著。氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)作為整個(gè)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，形成于蛋白質(zhì)折疊的早期[18]。mc1r編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，其次是無規(guī)則卷曲，其往往影響蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)以及亞細(xì)胞定位，并在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和嘌呤和嘧啶的運(yùn)輸過程中發(fā)揮作用。10個(gè)地理種群中緬樹鼩112個(gè)樣本共定義到了13個(gè)單倍型，對(duì)這13個(gè)單倍型采用Kimura 2-Parameter距離模型構(gòu)建ME系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示13個(gè)單倍型大致分為4支：海南種群為CladeⅠ一支(Hap5、Hap6)，大新種群為一支CladeⅡ(Hap3、Hap4)，片馬種群為一支CladeⅢ(Hap11)，其他種群聚為一支CladeⅣ。

圖4 基于Kimura 2-Parameter 距離構(gòu)建的不同單倍體間的ME系統(tǒng)發(fā)育樹(1000次重復(fù))

單倍型Halotype大理DL大新DX昆明KM海南HN河口HK樂業(yè)LY勐臘ML片馬PM西昌XC興義XYH18713555H241223H36H41H55H62H7153131H81H911H102H1113H121H131

表6 中緬樹鼩種群間的遺傳距離

表7 Mc1r基因序列飽和度檢驗(yàn)

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論，各地理種群單倍型雖然有所混雜，但在整體地理分布上趨于各自特有的地理格局，采樣地地形整體方面表現(xiàn)為海拔由西到東逐漸降低，片馬種群位于高黎貢山上即橫斷山脈南延部分，海拔在2500 m以上，年平均溫度在15℃左右，并且右側(cè)有怒江的阻隔作用，難以與其他種群進(jìn)行基因交流。而海南種群位于海南島上，處于典型的熱帶島嶼性季風(fēng)氣候，并且年平均溫度穩(wěn)定在25℃左右。其作為我國地理位置相對(duì)獨(dú)立的一個(gè)省份，海南島與廣州的雷州半島以及廣西壯族自治區(qū)之間分別有瓊州海峽和北部灣的阻隔作用，因此也難以與其他種群進(jìn)行交流。而大新種群所處地理位置海拔較低，周圍多為孤立的山峰形成屏障隔離難以與其他種群進(jìn)行基因交流。其他種群多生存于云貴高原及其周邊地區(qū)，由人為及其他因素原因影響導(dǎo)致種群間相對(duì)交流頻繁，難以各自分開。氣溫作為影響生物物種進(jìn)化的重要因素，其中的溫度和降水量兩個(gè)生態(tài)因子往往能影響陸生物種的進(jìn)化[19]，被毛顏色作為動(dòng)物抵御天敵捕食的最好偽裝，由多個(gè)因素來調(diào)控，基因調(diào)控只是一方面。有研究表明，合成真黑色素與偽黑色素的酶系對(duì)溫度比較敏感[20]，因此由于各地理環(huán)境的不同而表現(xiàn)出差異。

綜上所述，10個(gè)地理種群中緬樹鼩聚為四大類群，mc1r序列差異可能是由環(huán)境差異引起的。本研究主要從不同地理種群間中緬樹鼩mc1r序列差異上來分析，為下一步工作從基因表達(dá)量方面探討毛色的差異是如何形成的奠定了基礎(chǔ)。

[1]方美英,吳常信. 豬的毛色遺傳[J]. 中國畜牧雜志, 2002, 38(2):51-52.

[2]CONE R D, LU D, KOPPULA S, et al. The melanocortin receptors: agonists, antagonists, and the hormonal control of pigmentation [J]. Recent Progress in Hormone Research, 1996, 51 (7): 287-317.

[4]HUNT G, ROT HUIZEN J, VAN B A. Indemnification of 4 premature stop codon in the elanocyte mrnulating hormone receptor gene(MClR)in labrador and Golden rot rievers with yellow coat color [J]. Atom Genet, 2000, 31 (3): 194-199.

[5]LIBOUTET M, PORTELA M, DELESTAING G, et al. MC1R and PTCH gene polymorphism in French patients with basal cell carcinomas [J]. Digest of World Core Medical Journals, 2006, 126 (7): 1510-1517.

[6]王 樂, 呂雪峰, 鄭文新,等. 動(dòng)物毛色形成的原因和機(jī)制 [J]. 草食家畜, 2009(1): 20-21.

[7]SUZUKI I, CONE R D, IM S, et al. Binding of melanotropic hormones to the melanocortin receptor MC1R on human melanocytes stimulates proliferation and melanogenesis[J]. Endocrinology, 1996, 137 (5): 1627-1633.

[8]甘海云, 李建斌, 王洪梅,等. 牛毛色基因的研究進(jìn)展[J]. 中國草食動(dòng)物科學(xué), 2007, 27 (1): 50-52.

[9]王政昆, 高文榮, 朱萬龍. 橫斷山區(qū)三種小型哺乳動(dòng)物代謝特征的研究進(jìn)展[J]. 獸類學(xué)報(bào), 2015, 35 (4): 445-452.

[10]LIBRADO P, ROZAS J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics, 2009, 25(11): 1451-1452.

[11]YANG J, YAN R, ROY A, et al. The I-TASSER suite: Protein structure and function prediction[J]. Nature Methods, 2015, 12(1):7-8.

[12]ROY A, KUCUKURAL A, ZHANG Y. I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction [J]. Nature Protocols, 2010, 5(4): 725-738.

[13]SONNHAMMER E L, VON HEIJINE G, KROGH A. A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences[J].Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol, 1998, 6: 175-182.

[14]XIA X, XIE Z, SALEMI M, et al. An index of substitution saturation and its application[J]. Molecular Phylogenetics & Evolution, 2003, 26 (1): 1-7.

[15]XIA X, LEMEY P. The phylogenetic handbook: a practical approach to DNA and protein phylogeny[M]. Cambridge: Cambridge University Press，2009: 611-626.

[16]MERRELL D J. Ecological genetics[M]. London: Longman,1981:3-12.

[17]于永梅, 吳一遷, 錢耕蓀,等. 中緬樹鼩形態(tài)性狀的遺傳制約性初步研究[J]. 遺傳, 2004, 26 (4): 478-480.

[18]連云涓. 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測的多核學(xué)習(xí)方法[D]. 上海:上海交通大學(xué), 2013.

[19]孫儒泳. 動(dòng)物生態(tài)學(xué)原理[M]. 北京:北京師范大學(xué)出版社, 2001:18-20.

[20]張俊珍, 董常生, 范瑞文,等. 哺乳動(dòng)物毛色形成研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2006, 27 (增): 65-68.