鄧振山, 魏婷婷, 高 飛, 劉玉珍, 蘇 瑞, 陳邦凱, 莫達(dá)銳

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 延安 716000)

植物內(nèi)生菌(Plant endophyte)是存在于健康植物組織和器官中，而被感染的宿主植物不表現(xiàn)出明顯侵染癥狀的一類微生物。對植物內(nèi)生真菌研究發(fā)現(xiàn)，其次生代謝產(chǎn)物十分豐富，尤其是藥用植物內(nèi)生真菌中，包括了萜類、生物堿類、苯丙素類、黃酮類、甾體類、醌類、糖類、有機(jī)酸類、脂類、肽類等多種化合物[2]，內(nèi)生真菌能合成黃酮、生物堿、萜類、甾體等多種化合物，其中大多數(shù)化合物具有抗菌、抗癌、生物防治等活性[3]。因此從植物內(nèi)生菌中提取次生代謝活性物質(zhì)的研究活動(dòng)，且已取得了較大進(jìn)展。植物內(nèi)生菌不僅將植物作為其棲息場所，而且對寄主有促生、防病、內(nèi)生聯(lián)合固氮等廣泛的生物學(xué)作用，是植物病蟲害防治，內(nèi)生聯(lián)合固氮菌篩選，誘導(dǎo)抗病性及轉(zhuǎn)基因載體的天然菌源，具有較高的理論研究價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，已成為微生物和植物學(xué)學(xué)科的研究熱點(diǎn)[4]。

雖然自Bacon等[5]從黑麥草種子中分離出第一株內(nèi)生真菌至今已有100多年歷史，但直到20世紀(jì)30年代發(fā)現(xiàn)造成畜牧業(yè)重大損失的牧畜中毒是由于食用感染內(nèi)生真菌的牧草后，內(nèi)生菌的研究才得以廣泛的開展起來。Stierle等[6]從短葉紅豆杉的韌皮部分離到一株能產(chǎn)抗癌活性物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌,這才引起人們對內(nèi)生真菌產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)的極大注意。

酸棗[ZiziphusjujubaMILL. var.spinosa(Bunge)HuexH.F,Chow.]系鼠李科植物。我國北方野生酸棗資源十分豐富，主要分布在太行山區(qū)。酸棗肉中含有大量維生素C和19種氨基酸，其中8種為人體必需氨基酸。而且，在酸棗中檢測出31中微量元素，其中9種為人體必需微量元素。近年來對酸棗活性成分的分析和藥理作用進(jìn)行了大量的研究工作。

1 材料與方法

1.1 材料

酸棗材料選用陜北野生酸棗，大多采自延安大學(xué)后及延安市各個(gè)縣，采集酸棗側(cè)枝，采樣后立即帶回實(shí)驗(yàn)室用清水沖洗干凈。

1.1.1 供試培養(yǎng)基

1)固體分離培養(yǎng)基。①馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g；葡萄糖20 g；瓊脂18 g；蒸餾水1000 mL；pH自然；0.1 MPa，121℃滅菌30 min。

②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA):牛肉膏3 g；氯化鈉5 g；蛋白胨10 g；瓊脂18 g；蒸餾水1000 mL；pH 7.2；0.1 MPa，121℃滅菌20 min。

③高氏一號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g；氯化鈉0.5 g；硝酸鉀1 g；三水合磷酸氫二鉀0.5 g；七水合硫酸鎂0.5 g；七水合硫酸亞鐵0.01 g；瓊脂18 g；水1000 mL；pH 7.5；0.1 MPa，121℃滅菌20 min。

④水瓊脂培養(yǎng)基:瓊脂18 g；蒸餾水1000 mL；pH 7；0.1 MPa，121℃滅菌20 min。

⑤改良PDA培養(yǎng)基：酸棗莖浸汁；瓊脂18 g；馬鈴薯200 g；葡萄糖20 g；蒸餾水1000 mL；pH 7；0.1 MPa，121℃滅菌20 min。

⑥無機(jī)鹽培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀2.5 g；硫酸鎂0.2 g；硝酸銨3.0 g；硫酸亞鐵0.1 g；磷酸氫二鉀2.0 g；瓊脂20 g；蒸餾水1000 mL；pH 7；0.1 MPa，121℃滅菌20 min。

2)液體發(fā)酵培養(yǎng)基。上述1)種培養(yǎng)基不加瓊脂。培養(yǎng)基需0.1 MPa；0.1 MPa，121℃；滅菌20 min。

1.1.2 供試指示菌

供試指示菌有7種，具體見表1。

表1 供試指示菌

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離與純化

采用組織分離法[7]和四區(qū)劃線分離法進(jìn)行內(nèi)生菌分離、純化。用沖洗干凈的新鮮酸棗莖，濃度為95%的酒精浸泡3 min(除去表面的蠟層)→無菌水沖3～4次→濃度為0.1%升汞浸泡4～7 min(根據(jù)莖的生長狀況及采取部位而定)→無菌水沖洗4次。無菌操作，將上述處理過的材料剪切成0.5 cm的小段或者削成薄片，接種于平板培養(yǎng)基上(用滅過菌的鑷子輕輕按一下)，每板5～6塊，置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。當(dāng)觀察到組織塊邊緣有微生物長出后，將其接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。通過四區(qū)劃線分離法得到菌株純培養(yǎng)物，斜面4℃保存[8]。

表面消毒效果檢測：將最后一次沖洗組織的無菌水用滅過菌的涂布器均勻涂布于滅過菌的PDA培養(yǎng)基上，置于36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，每個(gè)樣設(shè)置3個(gè)重復(fù)，檢查是否有微生物長出。

1.2.2 內(nèi)生菌體外抑菌活性測定

將已篩出來的內(nèi)生菌以及病原菌轉(zhuǎn)接到牛肉膏固體培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)。待培養(yǎng)基上長滿內(nèi)生菌后，無菌條件下取直徑為1 cm的菌塊3～5個(gè)接種于滅菌的PDB培養(yǎng)基(250 mL三角瓶中加入100 mL液體培養(yǎng)基)，置于36℃±1℃恒溫?fù)u床，160 r/min振蕩18～24 h。無菌條件下，用滅過菌的棉簽將病原菌均勻涂滿牛肉膏固體培養(yǎng)基上，直徑10 mm 的無菌打孔器在涂滿病原菌的培養(yǎng)基上打孔并注入內(nèi)生菌發(fā)酵液。實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3次重復(fù)，置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～4 d后，觀察并測量抑菌圈直徑，對照組在孔中注入與實(shí)驗(yàn)組相同處理過的無菌水，對照組設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.3 菌株液體發(fā)酵及產(chǎn)物的粗提

將菌株B-08-12，B-08-20擴(kuò)大培養(yǎng)，無菌條件下，取直徑1 cm的內(nèi)生菌菌餅4～5塊，分別接種于含200 mL的發(fā)酵液培養(yǎng)基中，接種25瓶，共發(fā)酵5 L，置于36℃±1℃、160 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)器中5～7 d。經(jīng)水浴鍋將其蒸干。根據(jù)極性用等體積石油醚，乙酸乙酯，正丁醇、甲醇依次萃取[9]，濃縮后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 酸棗植株體有效成分提取

1)酸棗莖剪碎處理。取干凈的酸棗枝條，剪成1 cm長的小段。

2)溶劑提取。取酸棗莖的短段5個(gè)，料液比為1∶16，溫度100℃，加石油醚，于索式提取器中回流約2 h放冷，傾濾出溶劑，反復(fù)提取3次，合并，濾過，濾液置減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中回收溶劑，再用無水乙醇回流提取3次，每次2 h合并，濃縮并回收乙醇，得提取液，經(jīng)微孔濾膜過濾濃縮，置于4℃冰箱中備用。

1.2.5 薄層層析[11](TLC)分析

1)制板。將薄層層析硅膠與0.4%羧甲基纖維素鈉溶液混合(過程中可加3～4滴無水乙醇，起消泡作用)，充分研磨(朝一個(gè)方向)，倒在10 cm×5 cm玻璃板上，鋪勻，輕微振蕩，使液體均勻水平靜置晾干，使用前105℃活化30 min。2)點(diǎn)樣、展開。用毛細(xì)管分別吸取少量酸棗莖提取液、菌株發(fā)酵液，點(diǎn)于硅膠板底部，以酸棗莖提取液提取液為對照，每點(diǎn)重復(fù)點(diǎn)樣幾次，晾干。點(diǎn)樣后用氯仿∶甲醇(15∶1)混合液為展開試劑。3)顯色反應(yīng)。碘晶體顯色反應(yīng):揮干溶劑，放在盛有碘晶體的封閉容器中，完成顯色，并計(jì)算其Rf值。

Rf= 展開后起始線距斑點(diǎn)中心的距離∕展開后起始線距溶劑前沿的距離。

1.2.6 硅膠柱色譜法

采用濕法裝柱，先在層析柱內(nèi)加入約10 cm高的石油醚，打開閥門使之緩慢流出。將硅膠與石油醚浸泡搖勻，放入超聲清洗儀中超聲30 min，取出，沿玻璃棒一次性轉(zhuǎn)入層析柱內(nèi)，使硅膠沉積壓實(shí)。在硅膠頂端加一層濾紙片。干法上樣，取上述萃取物用甲醇溶解，用80～100目的硅膠拌樣，小心加到硅膠頂端，在其上面再加上一層濾紙片。選用薄層色譜的展開劑氯仿∶甲醇 (15∶1)作為洗脫劑。收集分離出的餾分，用薄層層析檢測合并相同組分。

1.2.7 紫外分光光度法

吸取3 mL甲醇至比色皿中，放入U(xiǎn)V2400的樣品池中校準(zhǔn)基線。取4中柱層析的分離物0.5 g于干燥的燒杯中→用甲醇將其溶解→然后用微孔濾膜過濾5～6次→用干燥的膠頭滴管吸取至比色皿中，放入樣品池中進(jìn)行測定。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件和IBM SPSS Statistics v20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性測定

采用平板對峙法對分離到的20株內(nèi)生菌進(jìn)行初步篩選。結(jié)果表明有3株內(nèi)生菌對一種或多種病原菌具有不同程度的拮抗作用，占分離菌株總數(shù)的15%。這3株均為內(nèi)生細(xì)菌，無內(nèi)生真菌與放線菌。篩選出的20株內(nèi)生菌形態(tài)特征見表2。其中B-08-12，B-08-20這倆株具有較強(qiáng)的抑菌活性，并且B-08-20還有較廣譜的拮抗作用，對7種指示菌中的5種均有抗性。20株內(nèi)生拮抗菌對7種病原菌的抑制效果見表3。其中，B-08-12，B-08-20抑菌現(xiàn)象明顯(見圖1)。

圖1 B-08-12,B-08-20對病原菌的抑制作用

a為B-08-12,B-08-20對病原菌P-1的抑制作用；b為B-08-12,B-08-20對病原菌P-2的抑制作用；c為B-08-12,B-08-20對病原菌P-3的抑制作用；d為B-08-12,B-08-20對病原菌P-4的抑制作用

表2 20株內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)特征

表3 20株內(nèi)生菌對指示菌的抑菌活性測定結(jié)果

抑菌圈直徑：“+”d≤5 mm;“++”5 mm

2.2 TLC檢測結(jié)果

TLC檢測結(jié)果表明：B-08-20菌株發(fā)酵液與標(biāo)準(zhǔn)酸棗莖提取液有相同的遷移率以及顯色斑。由圖2可知B-08-20菌株發(fā)酵液有1個(gè)褐色斑點(diǎn)，在Rf值為0.43與蘆丁對照品斑點(diǎn)Rf值0.43相同。并且在254 nm紫外燈下檢視觀察，可看見有一褐色點(diǎn)。

圖2 菌株B-08-20發(fā)酵液與酸棗莖提取液TLC圖譜比較

L為 蘆丁對照品；R為B-08-20菌株發(fā)酵液

2.3 紫外分光光度法檢測結(jié)果

經(jīng)紫外吸收光譜全波段掃描，樣品在200～600 nm樣品在203 nm處有最大吸收峰。經(jīng)查文獻(xiàn)對照黃酮類物質(zhì)在200～600 nm之間有吸收峰，可以初步確定該物質(zhì)為黃酮類物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同的植物中內(nèi)生菌的種類和數(shù)量有一定的差別，通過抑菌試驗(yàn)初步篩選，從酸棗莖中分離的20株內(nèi)生菌中獲得3株具有較強(qiáng)抑菌效果的菌株，占分離菌株數(shù)的15%，其中B-08-20的抗菌譜最廣，對4種不同的指示菌(1，2，3，4)均有強(qiáng)烈的拮抗作用。經(jīng)薄層層析(TLC)分析表明，B-08-20 菌株的發(fā)酵產(chǎn)物可與碘蒸氣發(fā)生特征性顏色反應(yīng)而呈現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，并通過紫外分光光度法進(jìn)一步分析證明B-08-20菌株可能具有可發(fā)酵產(chǎn)生酸棗黃酮類成分的能力。

圖 3 紫外吸收光譜圖

縱坐標(biāo)：OD值；橫坐標(biāo)：波長(nm)

在內(nèi)生菌的篩選中，共分離出20株菌，其中17株為細(xì)菌,真菌2株，放線菌1株，細(xì)菌占了絕對優(yōu)勢。這可能是酸棗莖中以內(nèi)生細(xì)菌為主，也可能與本實(shí)驗(yàn)技術(shù)、方法、條件的限制有關(guān)，未能充分篩選出酸棗莖中所有的菌株，特別是放線菌和真菌。因此在篩選植物內(nèi)生菌方面還有待于對傳統(tǒng)的篩選條件進(jìn)行改進(jìn)，采用更新型的篩選方法和技術(shù)，從而充分挖掘優(yōu)勢植物內(nèi)生菌資源。

本實(shí)驗(yàn)通過薄層層析和紫外分光光度法證明了酸棗莖內(nèi)生菌可產(chǎn)生與酸棗莖化學(xué)成分相似的化合物，這與藥用植物內(nèi)生菌具有產(chǎn)生與宿主活性成分相同或相似化合物的能力的相關(guān)報(bào)道是一致的?，F(xiàn)在許多藥用植物內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物的開發(fā)利用成為熱點(diǎn)。許多學(xué)者認(rèn)為內(nèi)生菌能合成與宿主相類似的代謝產(chǎn)物是由于它們具有相類似的代謝途徑，這些都為植物資源的保護(hù)提供了基礎(chǔ)。目前已有學(xué)者從其他植物中分離出黃酮類等活性成分，但從酸棗莖分離出黃酮類物質(zhì)以及產(chǎn)黃酮類化合物的內(nèi)生菌的研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從酸棗莖中分離出B-08-20活性菌株產(chǎn)黃酮類成分,這將為酸棗植株資源的有效利用奠定基礎(chǔ)，以及為黃酮類成分的提取提供另一個(gè)參考對象。同時(shí)，由于實(shí)驗(yàn)過程中提取方法、展開劑、顯色劑、色譜等條件的限制，本實(shí)驗(yàn)只對B-08-20酸棗莖內(nèi)生菌的黃酮這種產(chǎn)物進(jìn)行了初步的提取、分析，并未涉及其他產(chǎn)物。故仍需要利用其他生物化學(xué)手段進(jìn)行提取、純化、鑒定，從而充分挖掘該菌株次級代謝產(chǎn)物的多樣性。

本課題旨在尋找生產(chǎn)黃酮類化合物等活性物質(zhì)的內(nèi)生菌。雖然找到了具有發(fā)酵產(chǎn)生黃酮類化合物能力的內(nèi)生菌，但還未對其他拮抗菌株的其他活性成分，也未對這株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分類、鑒定、分析及其代謝產(chǎn)物是否具有藥用活性。本課題不僅可作為新型藥物的種質(zhì)資源，而且有利于維持生態(tài)平衡和植物資源保護(hù)。

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