胡 莉, 王小紅

(1. 黃淮學院 生物與食品工程學院, 駐馬店 463000; 2. 華中農業(yè)大學 食品科技學院, 武漢 430070)

黃曲霉毒素( Aflatoxins，AFs)是一類主要由黃曲霉、寄生曲霉等真菌分泌的次級代謝產物的總稱，這類化合物的化學結構基本類似，均含有二呋喃環(huán)和香豆素，前者為基本毒性結構，后者與致癌有關。目前已經(jīng)分離鑒定出的有將近20種，主要分子型式有B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最強，研究最為透徹，也是最具代表性的一種毒素[1]。1993年，AFB1被國際癌癥研究機構(international agency for research center，IARC)劃為I類致癌物質[2-3]，與乙型肝炎病毒一起成為肝癌的兩大誘因[4-5]。然而，食品中的黃曲霉污染非常常見，從農作物的生產到轉化為食物、從食物鏈的低端到頂端，AFB1都有可能造成淀粉類食品、肉類食品、蛋、奶類食品以及動物飼料等的連鎖污染，除此之外，AFB1還可通過皮膚接觸、飲食攝入等一些方式進入人和動物的機體。因此，對食品中黃曲霉毒素定量檢測變成一項很重要的工作[6]。目前的檢測方法主要有儀器法和酶聯(lián)免疫吸附法[7-8]，但前者耗時、耗力且成本較高、工序繁瑣。目前常采用酶聯(lián)免疫吸附法進行檢測，然而，該法需要高質量的抗體，因此，獲得高質量的抗AFB1scFv是上述研究方法的保證。scFv作為小分子功能性抗體，具有多種低成本的表達方式[9-11]，目前這種重組抗體已經(jīng)獲得許多研究學者的關注[12]。

外源蛋白采用真核表達系統(tǒng)進行表達，能夠有效避免在原核表達系統(tǒng)中的不足，表達的外源蛋白能得到較為完整的加工修飾，其構象與天然蛋白質的分子結構模式也較為接近，相對于原核表達系統(tǒng)表達外源蛋白的生物活性也較高，因此，真核表達系統(tǒng)表達外源蛋白越來越受到研究者們的青睞[13]。

畢赤酵母表達系統(tǒng)，可以將甲醇作為碳源使用，因此也叫甲醇營養(yǎng)型表達系統(tǒng)。其內有編碼醇氧化酶的AOX1 基因，當培養(yǎng)基中的碳源耗盡時，加入甲醇，AOX1基因會啟動轉錄醇氧化酶物質，該物質可以將甲醇轉化為醛類物質，進而轉化成酵母生長所需要的能量[14]。其次AOX1是強啟動子，能夠多次有效啟動轉錄編碼區(qū)，使得誘導外源基因的表達時，具有較高的效率和蛋白表達量[15]。畢赤酵母表達系統(tǒng)操作簡單、穩(wěn)定性好、生產成本低、繁殖速度快和易于高密度生產發(fā)酵的優(yōu)勢使得它的應用極為廣闊[16-17]。鑒于此，本實驗選用大腸桿菌表達系統(tǒng)和甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)進行抗黃曲霉毒素B1單鏈抗體的分泌表達并進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

AFB1購于瑞士Alexis公司；畢赤酵母GS115菌株、表達載體pPICZαA、pET-30a、pET-22b及E.coli菌株Trans5α均為本實驗室常規(guī)保存；AFB1-O-OVA實驗室自制； EasyTaq酶、 Trans5K Plus DNA Marker、Trans2K Plus DNA Marker購于中國北京全式金生物技術有限公司；Ni-NTA 親和層析填料、ECL 顯色液、Page RulerPrestained Protein Ladder購于美國Thermo公司；雜交瘤細胞株2C10由本實驗室培養(yǎng)并保存；YNB、Zeocin購自Invitrogen公司；質粒小提、DNA 凝膠回收試劑盒購于杭州AxyGen；所用引物的合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；羊抗小鼠IgG-HRP酶標二抗購于中國華美生物工程公司； DNA連接酶、限制性內切酶、T4連接酶、dNTP、 PMD19-T Simple Vector 購自TaKaRa公司； DNA凝膠回收純化試劑盒由中國北京莊盟國際生物基因科技有限公司提供；質粒提取試劑盒購于中國北京擎科新業(yè)生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與目的基因擴增

以實驗室已經(jīng)成功構建的重組載體pMD19-T-VH-2C10和pMD19-T-VL-2C10分別為模板，設計相應的引物，通過PCR擴增獲得scFv-2C10片段，并在目的基因兩端分別引入XbalⅠ(NcoⅠ)和EcoRⅠ(XhoⅠ)酶切位點，其次，考慮到后續(xù)的純化工作，在引物設計時特別引入histag 標簽，其具有可以特異性的結合鎳離子的功能，方便重組蛋白的純化和回收。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如下所示:

引物1:CATGTCTAGA(CCATGG)CGGAGGTGAAGCTGGTGGAG [劃線處為酶切位點XbalⅠ(NcoⅠ)]

引物2:GCCACCGCCGGATCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT(劃線處為部分linker序列)

引物3: GGCGGTGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCCCAGGCTGTTGTGACTCAGGAA(劃線處為部分linker序列)

引物4: CCGGAATTC(CTAGAG)TTAGTGGTGATGGTGATGATGCTTGGGCTGACCTAGGACAGT(劃線處為酶切位點EcoRⅠ(XhoⅠ)，波浪線為histag 標簽)

首先，以引物1和引物2為引物，PCR擴增出帶有部分Linker的VH-Linker片段；以引物3和引物4為引物，PCR擴增出帶有部分Linker的Linker-VL片段。PCR 擴增條件如下：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，28個循環(huán)；72℃延伸8 min。每輪PCR后，將3 μL PCR產物與1 μL 6×Loading buffer混勻，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析并借助凝膠回收試劑盒純化回收PCR產物VH-Linker和Linker-VL。然后，通過重疊延伸PCR法(gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR)構建scFv-2C10基因，SOE-PCR分兩步：第一步，以上述回收的產物VH-Linker和Linker-VL為模板進行PCR 擴增反應，將VH 和VL 通過Linker連接合成一條單鏈。PCR擴增條件如下：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個循環(huán)；72℃延伸8 min。經(jīng)0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收PCR產物。第二步，以第一步純化產物為模板，以引物1和引物4為引物，PCR擴增scFv-2C10基因。PCR 擴增條件如下：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min；30個循環(huán)；72℃延伸10 min。經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收PCR產物scFv-2C10。根據(jù)所用引物的不同，最后獲得兩種不同的PCR產物，即為NcoⅠ-scFv-2C10-XhoⅠ和XbalⅠ-scFv-2C10-EcoRⅠ。

1.2.2 重組質粒pET-30a-pelB-scFv的構建和鑒定

pelB信號肽可以引導蛋白產物在細胞周質表達，為了方便后續(xù)的蛋白純化工作，現(xiàn)將pET-22b載體上的pelB信號肽序列克隆到最終使用載體pET-30a上，方法分為兩步，首先將“1.2.1” 中第二步獲得的PCR產物NcoⅠ-scFv-2C10-XhoⅠ和質粒pET-22b均采用限制性內切核酸酶NcoⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，純化回收產物后，采用DNA連接酶將scFv-2C10和pET-22b進行連接獲得重組質粒pET-22b-scFv-2C10，并轉化E.coliTrans5α細胞。挑取單克隆進行菌落PCR驗證。

然后提取上述陽性克隆子pET-22b-scFv-2C10的質粒，純化后將重組質粒pET-22b-scFv-2C10和質粒pET-30a分別用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，純化回收產物后，采用DNA連接酶將pelB-scFv-2C10和pET-30a進行連接獲得重組質粒pET-30a-pelB-scFv-2C10，并轉化E.coliTrans5α細胞。挑取單克隆進行菌落PCR驗證，選取陽性轉化子送至南京金思瑞生物科技有限公司測序。

測序正確的陽性轉化子培養(yǎng)并提取質粒后，將空載體pET-30a和所提取質粒分別轉化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑取菌落轉化子進行PCR驗證，陽性轉化子分別命名為BL21(DE3)-pET-30a和BL21(DE3)- pET-30a-pelB-scFv-2C10。

1.2.3 重組質粒pET-30a-pelB-scFv的表達及鑒定

無菌條件下挑取1.2.3中轉化成功的單菌落轉化子BL21(DE3)-pET-30a和BL21(DE3)- pET-30a-pelB-scFv-2C10，分別培養(yǎng)于100 mL液體LB培養(yǎng)基中(含有100 μL 的50 mg/mL的kana)，于200 r/min 、37℃條件下培養(yǎng)至OD600為0.8左右時，加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)并使其終濃度為1 mmol/L、16℃誘導表達20 h，多次試驗發(fā)現(xiàn)，誘導時間為20 h時蛋白表達量達到最高。收集菌體，進行蛋白預表達分析實驗。

由于pelB信號肽的存在，所以基本確定目的蛋白主要存在于細胞周質內。又由于只有當新生肽鏈的合成速率大于蛋白折疊速率時，蛋白才會以包涵體的形式存在，而肽鏈的合成速率又與溫度有著直接的關系，所以我們選擇16℃低溫誘導蛋白的表達可以有效地避免包涵體形式的形成，且實驗證明的確如此。

采用SDS-PAGE對scFv-2C10的預表達情況進行驗證分析，將破碎后的菌體細胞4℃低溫離心，可溶性蛋白經(jīng)鎳柱親和層析法進行蛋白純化，純化后的蛋白與上樣緩沖液混勻后煮沸6 min直接上樣，經(jīng)SDS-PAGE驗證后，接著轉印PVDF膜，再以5%牛奶封阻PVDF膜，最后采用羊抗小鼠IgG-HRP 酶標二抗孵育后，利用ECL顯色液顯色，觀察結果。

1.2.4 重組質粒pPICZαA-scFv的構建和鑒定

將“1.2.1” 中第二步獲得的PCR產物XbalⅠ-scFv-2C10-EcoRⅠ和質粒pPICZαA均采用限制性內切核酸酶XbalⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，純化回收產物后，采用DNA連接酶將scFv-2C10和pPICZαA進行連接獲得重組質粒pPICZαA-scFv-2C10，并轉化E.coliTrans5α細胞。挑取單克隆進行菌落PCR驗證，選取陽性轉化子送至南京金思瑞生物科技有限公司測序。

1.2.5 畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞制備

1)挑取畢赤酵母GS115單菌落于5 mL液體YPD 培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min活化培養(yǎng)16 h;

2)將活化好的1 mL 菌液轉接于100 mL的液體YPD培養(yǎng)基中，28℃、2000 r/min 培養(yǎng)至OD600約于1.2時，將菌體轉入45 mL的離心管中、4200 r/min、4℃離心5 min；

3)棄上清，菌體沉淀用冰冷的無菌蒸餾水重懸，4200 r/min、4℃離心5 min；

4)棄上清，重復(3)1次；

5)棄上清，菌體用1 mol/L冰冷的無菌山梨醇重懸，4200 r/min、4℃離心5 min；

6)棄上清，重復(5)1次；

7)棄上清，菌體用1 mol/L冰冷的無菌山梨醇重懸，分裝成80 μL/管，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10質粒的線性化

對空載E.coliTrans5a-pPiczαA菌株和測序正確的菌株進行質粒提取，用限制性內切酶BstXⅠ對質粒E.coliTrans5a-pPiczαA、E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10進行線性化酶切，45℃條件下，酶切20 h。以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳驗證酶切結果，然后回收酶切線性產物E.coliTrans5a-pPiczαA和E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10，以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗回收效果。

1.2.7 重組質粒轉化畢赤酵母及鑒定

將1.2.3中保存的感受態(tài)細胞80 μL和10 μg回收的線性化質粒(E.coliTrans5a-pPiczαA和E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10)分別進行混勻后，一起加入已經(jīng)預冷30 min的電轉杯中(0.2 cm)，冰上靜置5 min；將電轉儀調至Fungi 檔，2000 V進行電擊轉化，電轉產物迅速加入1 mL預冷的1 mol/L無菌山梨醇混勻，將混合產物轉移到2 mL的EP管中，28℃，200 r/min 孵育2 h；取孵育好的產物200 μL 輕輕涂在固體YPD平板(含有100 μg/mL 的博萊霉素)上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d左右，挑取菌落轉化子進行PCR驗證，轉化子命名為GS115-pPiczαA和GS115-pPiczαA-scFv-2C10。

1.2.8 重組酵母的表達及鑒定

無菌條件下挑取轉化成功的單菌落轉化子GS115-pPiczαA和GS115-pPiczαA-scFv-2C10分別轉到BMGY培養(yǎng)基中，于28℃條件下培養(yǎng)至OD600為4左右時，離心回收菌體并將其重懸于100 mL BMMY培養(yǎng)基中，實驗設置兩個平行組，兩組均培養(yǎng)至OD600為1.2左右，200 r/min、28℃條件下加入甲醇進行誘導表達，并且每隔24 h向培養(yǎng)基中再次添加甲醇，并使其終濃度為0.5%，第一小組誘導滿20 h后，收集菌體和上清，進行蛋白預表達分析實驗。通過第二小組實驗發(fā)現(xiàn)，當誘導滿72 h后，蛋白表達量達到最高。

采用SDS-PAGE對scFv-2C10的預表達情況進行驗證分析。檢測結果表明，上清液中的目的蛋白幾乎不存在，而菌體中的目的蛋白要多得多。所以接著采用Western blot 對菌體目的蛋白scFv-2C10進行驗證分析。將破碎后的菌體細胞經(jīng)鎳柱親和層析法進行蛋白純化，純化后的蛋白采取同1.2.3中同樣的驗證方法進行初步驗證，最后采用ECL顯色液顯色，觀察并分析結果。

1.2.9 抗AFB1 scFvs-2C10的性質分析

以20 mL PBS緩沖溶液懸浮，在冰浴條件下將細胞超聲破碎(30 min，功率105 W，2 s開啟，2 s關閉)，4℃下10 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用鎳柱親和層析純化上清液，純化后所得到的蛋白經(jīng)SDS-PAGE初步驗證后，再以間接競爭 ELISA 檢測上述兩種表達載體所表達的目的蛋白抗 AFB1scFv-2C10的靈敏度，試驗中以pET-30a和pPICZαA兩種空載體的表達為陰性對照。

用CBS緩沖液稀釋AFB1O-OVA為1 μg/mL包被96孔板過夜，PBST洗滌甩干。每孔加入200 μL封阻液，37℃靜置2 h，甩干封阻液，PBST洗滌甩干。每孔加入90 μL用PBST 稀釋的抗AFB1 scFv-2C10和10 μL以PBS 稀釋的不同濃度的AFB1 溶液(濃度分別為2、8、20、40和60 μg/mL)，37℃靜置1 h，甩干液體，PBST洗滌甩干。每孔加入100 μL 的羊抗鼠IgG-HRP酶標二抗(以PBST 4000倍稀釋)，37℃靜置1 h，甩干液體，PBST洗滌甩干。每孔加底物緩沖液100 μL后，37℃靜置15 min，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應，492 nm 測吸光值。

2 結果

2.1 目的基因scFv-2C10擴增

以質粒pMD19-T-VH-2C10和pMD19-T-VL-2C10分別為模板，經(jīng)SOE-PCR第一步擴增產物為模板，進行第二步PCR獲得兩端帶有酶切位點的產物scFv-2C10基因。經(jīng)0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，大小約為750 bp，與理論值一致。回收試劑盒回收scFv-2C10基因片段。

2.2 重組質粒pET-30a-pelB-scFv的構建及鑒定

將pET-30a質粒和回收產物pelB-scFv-2C10分別進行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切反應和連接反應，獲得重組質粒pET-30a-pelB-scFv。將重組質粒轉化到E.coliTrans5α細胞，挑取轉化子，以引物1和引物4對其進行菌落PCR驗證(圖2-A)，PCR產物大小約為750 bp，與理論預期值一致。測序結果進一步驗證了重組質粒構的建成功。

圖1 scFv基因的PCR擴增結果

M：Trans2K DNA Marker；1：scFv-2C10 gene fragments

將測序成功的陽性轉化子pET-30a-pelB-scFv和空質粒pET-30a分別轉化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，轉化子進行PCR驗證(圖2-B)，PCR產物大小約為750 bp，與理論值一致。

圖2含目的基因的轉化子PCR驗證結果Fig 2 PCR results of transformants containing target gene

A：M為Trans5K Plus DNA Marker; 1、2為different transformants containg scFv-2C10 gene。B：M為Trans5K Plus DNA Marker; 1～10為different transformants containg scFv-2C10 gene

2.3 重組質粒pET-30a-pelB-scFv的表達及鑒定

挑取固體LB平板上生長的陽性菌落進行誘導表達，鎳柱親和法純化表達蛋白，采用SDS-PAGE和Western blot 對抗AFB1scFv-2C10蛋白進行驗證，結果見圖3。由圖可知，SDS-PAGE和Western blot鑒定結果表明已成功誘導表達了目的蛋白，該蛋白質分子質量約為29 ku，與目的蛋白理論值一致。BCA法測定誘導20 h純化后目的蛋白的產率約為34 mg/L。

2.4 重組質粒pPiczαA-scFv的構建及鑒定

將pPICZαA質粒和回收產物scFv-2C10分別進行XbalⅠ和EcoRⅠ雙酶切反應和連接反應，獲得重組質粒pPICZαA-scFv-2C10。將重組質粒轉化到E.coliTrans5α細胞，挑取轉化子，以引物1和引物4對其進行菌落PCR驗證(圖4-A)，PCR產物大小約為750 bp，與理論預期值一致。與測序結果進行對比后，進一步驗證了重組質粒的構建成功。

圖3抗AFB1 scFv-2C10表達的SDS-PAGE和Western-blot分析Fig 3 SDS-PAGE and Western-blot analysis for expression of anti-AFB1 scFv-2C10

A：抗AFB1scFv-2C10表達的SDS-PAGE分析;B：純化后的抗AFB1scFv-2C10的SDS-PAGE分析;C：抗AFB1scFv-2C10表達的Western-blot分析。M：Marker；1：purified scFv-2C10

線性化質粒E.coliTrans5a-pPiczαA和E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10分別與GS115感受態(tài)細胞進行混勻后，進行電轉化，挑取3 d左右的培養(yǎng)皿中的轉化子進行PCR驗證(圖4 B)，PCR產物大小約為750 bp，與理論值一致。

圖4 含目的基因的轉化子PCR驗證結果Fig 4 PCR results of transformants containing target gene

A：M為Trans5K Plus DNA Marker; 1、2為different transformants containing scFv-2C10 gene； B：M為Trans5K Plus DNA Marker; 1～10為different transformants containing scFv-2C10 gene

2.5 重組酵母的表達及鑒定

挑取YPD 平板上生長的陽性菌落進行誘導表達，鎳柱親和法純化表達蛋白，采用SDS-PAGE和Western blot 對抗AFB1scFv-2C10蛋白進行驗證，結果見圖5。由圖可知，SDS-PAGE和Western blot鑒定結果表明已成功誘導表達了目的蛋白，該蛋白質分子質量約為29 ku，與目的蛋白理論值一致。BCA法測定誘導72 h后純化的目的蛋白的產率約為132 mg/L。

2.6 抗AFB1scFv-2C10的性質分析

分別以間接非競爭ELISA和間接競爭ELISA純化后的scFv-2C10進行分析。間接非競爭ELISA 表明，AFB1O-OVA包被濃度為1 μg/mL，抗AFB1scFv-2C10的濃度約為0.17 mg/mL時，OD492約為1.0。在此條件下，以AFB1為競爭抗原，進行間接競爭ELISA檢測不同表達系統(tǒng)表達的目的蛋白的靈敏度，并取5個點以繪制scFv-2C10的間接競爭抑制曲線，由圖6可知，兩種表達系統(tǒng)得到的目的蛋白scFv-2C10的檢測靈敏度分別約為40 μg/mL和35 μg/mL，結果表明采用酵母表達系統(tǒng)獲得的目的蛋白scFv-2C10與AFB1的結合活性較同一種蛋白采用E.coliBL21(DE3)表達時要稍有好轉，但是仍然沒有達到預期目標。

圖5 抗AFB1 scFv-2C10表達的SDS-PAGE和Western-blot分析Fig 5 SDS-PAGE and Western-blotanalysis for the expression of anti-AFB1 scFv-2C10

A：抗AFB1 scFv-2C10表達的SDS-PAGE和Western-blot分析；B：純化后的抗AFB1 scFv-2C10的SDS-PAGE分析；C：抗AFB1 scFv-2C10 表達的Western-blot分析。M：Marker；1：purified scFv-2C10

3 討論

基于AFB1的毒性，其檢測的極限尤為重要。目前的檢測分析方法中使用較廣的是酶聯(lián)免疫吸附法，該法以檢測快速、靈敏、樣品制備簡單等優(yōu)點而廣受關注。在該檢測方法中，抗體是核心試劑，以實驗室保存的抗AFB1單克隆雜交瘤細胞株為原料構建scFv 基因。

目前，對于外源蛋白的表達，E.coli表達系統(tǒng)是應用較多、研究較多的，也最具有代表性的，E.coli作為AFB1scFv的表達系統(tǒng)，E.coli具有操作方便快速、實驗周期不長、生產成本小等優(yōu)點。但其不能對蛋白質進行有效的翻譯后修飾( 如二硫鍵形成、蛋白質折疊等)，存在一定局限性。而真核細胞表達系統(tǒng)的翻譯后修飾機制接近天然形式。

圖6 scFv-2C10的間接競爭ELISA抑制曲線Fig 6 IC-ELISA inhibition curves of pET-30a-pelB-scFv (A) and pPICZαA-scFv (B)

畢赤酵母表達系統(tǒng)又稱甲醇酵母表達系統(tǒng)，是因為畢赤酵母中的醇氧化酶AOX1基因，在當甲醇作為碳源時，醇氧化酶可以將甲醇轉化為醛類物質，進而再在其他酶類的作用下，轉化成酵母所需要的能量，以供酵母細胞的生長繁殖。當線性化的重組質粒在5′AOX1和3′AOX1之間和宿主菌的基因組發(fā)生同源重組時，就成功地獲得了整合基因組的轉化子?？刂拼佳趸皋D錄的啟動子(PAOX1)是強啟動子，當培養(yǎng)液中加入甲醇時，PAOX1可以更高效啟動醇氧化酶的轉錄，而目的基因也正好處于其中，所以畢赤酵母表達系統(tǒng)的外源蛋白的產量較高。又由于它是真核表達系統(tǒng)，所以外源蛋白在構象上折疊的更成熟。

pelB信號肽可以引導目的蛋白在細胞周質內表達，并且采取一定的手段可以避免包涵體的形成，增加可溶蛋白的表達，提高純化效率[18]?；诖?，實驗先將目的基因克隆到帶有pelB信號肽的載體pET-22b上，再將pET-22b上的pelB信號肽序列和目的基因序列一同克隆到載體pET-30a上，這樣是為了充分利用pelB信號肽的上述特性?；诖?，實驗還將目的基因采用了畢赤酵母表達體系進行蛋白表達以與E.coli表達體系相比較。最終本研究成功構建了兩種重組載體pET-30a-pelB-scFv-2C10和pPiczαA-scFv，并將其轉化到相應的表達細胞中進行蛋白表達，以期望scFv的親和力和蛋白表達量能有所提高。實驗結果顯示，酵母表達系統(tǒng)中獲得的目的蛋白的最高表達量132 mg/L是E.coli表達系統(tǒng)中蛋白最高表達量的4倍。經(jīng)ELISA實驗結果表明，兩種表達系統(tǒng)得到的目的蛋白scFv-2C10均顯示出較好的活性，經(jīng)檢測，靈敏度分別約為40 μg/mL和35 μg/mL，這說明在酵母表達系統(tǒng)中目的蛋白的活性得到了一定的提高，原因可能是scFv得到了較為充分的折疊和翻譯后修飾。但是距離預期目標仍有較大的差距，接下來的實驗還需要大量的分析和改進，分析其原因可能是因為scFv的自身編碼基因的親和力不夠高，所以在未來的實驗中，可能會采取基因工程技術手段，如基因定點突變或隨機突變等對scFv的親和力進行提高。

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