聶二旗,張心昱,鄭國砥,楊 洋,王輝民,陳伏生,孫曉敏

1 中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)觀測與模擬重點實驗室,北京 100101 2 中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所環(huán)境修復(fù)中心,北京 100101 3 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049 4 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省竹子種質(zhì)資源與利用重點實驗室,南昌 330045

在亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)中,氮(N)、磷(P)有效性限制著森林初級生產(chǎn)力和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性[1]。然而,最近半個世紀由于人類活動等因素的影響,大氣N沉降逐漸增加,導(dǎo)致亞熱帶土壤中N素有效性增加,N/P比失衡,P素相對更加缺乏[2]。養(yǎng)分有效性的增加會影響微生物對養(yǎng)分的需求,改變微生物對有機質(zhì)的分解,影響土壤中的碳儲存[3]。土壤C、N礦化將土壤中有機質(zhì)分解成CO2和無機氮,并且對森林生態(tài)系統(tǒng)CO2排放和N養(yǎng)分供應(yīng)中起著重要的作用[4]。盡管N添加對于C、N礦化影響的研究較多[5-6],而結(jié)論還不一致,有促進[5,7],抑制[5,8],無影響[9]。P素作為亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)主要的限制因子,在C、N循環(huán)的過程中起著重要的調(diào)控作用[10],而目前關(guān)于外源P素輸入對C、N礦化的影響還鮮見報道[5]。

土壤微生物是有機質(zhì)中C、N礦化的主要驅(qū)動者[11],能夠產(chǎn)生胞外酶催化土壤中有機質(zhì)的分解,其水解酶活性能夠反應(yīng)微生物對于能量和養(yǎng)分的需求[12-13]。其中,β-1,4-葡萄糖苷酶(βG)能夠分解纖維素二糖為葡萄糖,是表征土壤碳礦化的重要微生物指標。β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(NAG)能夠降解幾丁質(zhì)和肽聚糖,將殼二糖水解為氨基葡萄糖,是表征土壤碳、氮礦化的重要微生物指標[14]。N、P添加通過調(diào)節(jié)微生物的底物有效性,進而影響微生物分泌酶的活性,目前研究發(fā)現(xiàn)N、P添加對土壤βG、NAG潛在最大酶活性(Vmax)的影響有促進、抑制、無影響[15-16],但潛在最大酶活性是飽和底物濃度下酶活性[17],未反映土壤中底物濃度對酶活性的影響。酶動力學(xué)特征一般遵循米氏方程,可以反映不同底物濃度下的酶活性,完整的描述酶的催化進程[18]。米氏方程中的半飽和常數(shù)(Km)是反應(yīng)速率為酶最大反應(yīng)速率一半時的底物濃度,與酶的本質(zhì)屬性有關(guān),是表征酶與底物親和力的常數(shù),其值越小,酶與底物的親和力越強,即酶-底物復(fù)合體的形成能力越強[19],酶動力學(xué)參數(shù)Vmax/Km可反映酶的催化效率[18]。所以開展N、P添加對土壤βG、NAG的動力學(xué)參數(shù)的影響具有重要的意義。

本文選擇亞熱帶杉木人工林,開展野外長期N、P添加控制試驗,分析N、P添加對杉木林土壤C、N礦化、βG和NAG動力學(xué)特征參數(shù)的影響,并分析土壤養(yǎng)分與土壤C、N礦化速率、酶動力學(xué)特征參數(shù)的關(guān)系,以期為未來氮沉降增加背景下亞熱帶森林土壤C、N礦化研究提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 研究區(qū)域概況

1.1 研究區(qū)概述

試驗樣地位于江西省泰和縣中國科學(xué)院千煙洲石溪林場 (26°44′52″N,115°04′13″E),該區(qū)地處亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū),雨量充沛,四季分明,海拔102m,年平均氣溫17.9℃,年平均無霜期280d,年平均降雨量1471mm,是典型的紅壤丘陵地貌,成土母質(zhì)多為紅色砂巖、砂礫巖或泥巖以及河流沖積物,地處中亞熱帶常綠闊葉林區(qū),由于原有植被被破壞,現(xiàn)多為人工林,森林覆蓋近70%,主要樹種為1985年前后種植的馬尾松(Pinusmassoniana) 、濕地松(PinuselliottiiEngelem) 和杉木(Cunninghamialanceolate)[20- 21]。

1.2 試驗設(shè)計

杉木人工林N、P添加控制試驗共4個處理,對照(CK)、N(50 kg N hm-2a-1)、P(50 kg P hm-2a-1)、NP(50 kg N hm-2a-1+50 kg P hm-2a-1)氮肥為NH4NO3,磷肥為NaH2PO4。每個處理5次重復(fù)(n=5),各小區(qū)面積400m2(20m×20m),共20個小區(qū),按隨機區(qū)組設(shè)計小區(qū)間隔>10 m,各小區(qū)隨機排列,其中每個小區(qū)中劃分4個亞小區(qū),允許土壤破壞性采樣的面積為10m×10m,其他區(qū)域為永久觀測區(qū)。自2012年開始施肥,每年4次,分別為3、6、9和12月,其中生長季6月和9月施肥量均為全年的30%,非生長季3月和12月施肥量均為全年的20%。本研究選擇2014年11月采樣,在每個允許土壤破壞性采樣的亞小區(qū)中隨機選取5點,除去地表凋落物層后,用直徑2cm的土鉆采集0—10cm土壤樣品,過2mm篩,挑除根系后,自封袋密封保存,冷藏箱運回實驗室,在4℃冰箱冷藏備用。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤碳、氮礦化速率

釆用室內(nèi)需氧連續(xù)培養(yǎng)法[22],測定有機碳、氮礦化速率。培養(yǎng)前根據(jù)測定的土壤含水量,經(jīng)過含水率公式換算后,再取相當(dāng)于40g干土重的新鮮土樣于150mL塑料瓶中,瓶蓋上有3個直徑約為2mm的透氣小孔。將樣品在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天進行稱重補充水分,保持土壤含水量不變。在培養(yǎng)的第14天,進行土壤碳、氮礦化速率的測定。

采用自主研發(fā)裝置測定碳礦化速率,該裝置主要由Li-COR(Li- 7000) CO2紅外濃度分析儀、數(shù)據(jù)采集器、低溫循環(huán)儀、恒溫水浴鍋和電磁閥等組成。試驗測定中系統(tǒng)可根據(jù)實驗需求調(diào)節(jié)裝置內(nèi)起始CO2濃度、測試時間并能自動轉(zhuǎn)換測定樣品[23],土壤碳礦化速率計算公式如下：

式中:Cmin為土壤碳礦化速率(μg C g-1d-1)；C為測試時間內(nèi)CO2濃度變化的直線斜率；V為包括培養(yǎng)瓶和管線等所有氣體體積；m為培養(yǎng)瓶內(nèi)土壤轉(zhuǎn)化為干土質(zhì)量；α為CO2氣體體積轉(zhuǎn)化為質(zhì)量的系數(shù)；β為時間(s)轉(zhuǎn)化為天數(shù)的系數(shù)。

稱取培養(yǎng)前后1g土樣,測定土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量,進行氮礦化速率的計算[24]

R銨=(NB銨-NA銨)/d

R硝=(NB硝-NA硝)/d

Nmin=(NB銨+NB硝-NA銨-NA硝)/d

式中：NB銨為培養(yǎng)后銨態(tài)氮量；NB硝為培養(yǎng)后硝態(tài)氮量；NA銨為培養(yǎng)前銨態(tài)氮量；NA硝為培養(yǎng)前硝態(tài)氮量；Nmin為土壤凈氮礦化速率；R銨為土壤氨化速率；R硝為土壤硝化速率；d為培養(yǎng)時間。

1.3.2 酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)

土壤βG和NAG活性分析采用微孔板熒光法(Saiya-Cork, 2002),分別利用4-甲基傘形酮酰-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUB-β-D-glucopyranoside)和4-甲基傘形酮- 2-乙酰氨基- 2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUB-N-acetyl-b-D-glucopyranoside)做βG和NAG的底物,應(yīng)用多功能酶標儀(SynergyH4, BioTek)在365nm熒光處激發(fā),450nm處進行熒光檢測。βG和NAG底物均設(shè)置8個濃度梯度(5、10、20、30、40、60、100、200μmol/L),并設(shè)置8個重復(fù),避光條件下,恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后進行測定。

將測定的酶活性和底物濃度利用SigmaPlot10軟件進行米氏方程曲線擬合,求出最大酶促反應(yīng)速率(Vmax)和半飽和常數(shù)(Km)：

V=Vmax[S]/ (Km+[S])

式中,V為酶促反應(yīng)速率,Vmax為最大酶促反應(yīng)速率,S為底物濃度,Km為半飽和常數(shù),即酶促反應(yīng)速率達到1/2Vmax時的底物濃度,可用來表示酶與底物的結(jié)合程度。

1.3.3 土壤理化性質(zhì)

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan多重比較對各指標進行顯著性檢驗,顯著性水平P<0.05；采用主成分分析(PCA)方法評價不同處理對土壤性質(zhì)、Cmin和Nmin、βG和NAG動力學(xué)參數(shù)的影響；利用Pearson檢測Cmin、Nmin和βG和NAG動力學(xué)參數(shù)及土壤環(huán)境因子之間的相關(guān)性。用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析,Sigma Plot 10.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮磷添加對土壤理化性質(zhì)的影響

表1 氮、磷添加對土壤理化性質(zhì)影響

每列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05,n=5),數(shù)據(jù)表示平均值(標準誤差);N (50kg N hm-2a-1), P (50kg P hm-2a-1), NP (50kg N hm-2a-1+ 50kg P hm-2a-1)

2.2 氮磷添加對土壤碳氮礦化速率的影響

N比CK的Cmin低25%(P<0.05),P、NP對Cmin的影響較CK均不顯著；N添加顯著的抑制了Nmin(P<0.05),N、NP主要通過抑制R銨使土壤Nmin較CK分別降低了18%和8%,其中,NP較CK 使Nmin減小達到顯著水平(P<0.05)(圖1)。

2.3 氮磷添加對土壤酶動力學(xué)的影響

土壤βG和NAG的活性與底物濃度的擬合均遵循米氏方程(圖2)。N添加使βG的酶動力學(xué)參數(shù)Vmax、Km較CK(66nmol h-1g-1、53μmol/L)增加了36%、13%(P<0.05),但對酶的Vmax/Km影響不明顯(P>0.05)。P輸入(P、NP)降低了NAG的Vmax、Km,比CK降低了26%—60%(P<0.05)。NP同時添加使βG和NAG的Vmax/Km值分別較CK增加了61%、89%(P<0.05)(表2)。βG和NAG的動力學(xué)參數(shù)Vmax與Km之間均顯著正相關(guān)(P<0.05)(圖3)。

圖1 氮磷添加對土壤碳氮礦化速率的影響Fig.1 The effects of nitrogen and phosphorus additions on the rates of soil carbon and nitrogen mineralization

圖2 氮磷添加條件下β-1,4-葡萄糖苷酶(βG)和β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(NAG)米氏方程擬合結(jié)果Fig.2 Michaelis-Menten equation of β-glucosidase (βG) and N-acetyl-glucosaminidase (NAG) under N and P additions

處理TreatmentVmax/(nmolh-1g-1)Km/(μmol/L)Vmax/Km/h-1βGNAGβGNAGβGNAGCK66±11b34±0a53±12b38±3a1．3±0．13b0．9±0．06bN89±3a27±2b85±7a38±1a1．0±0．05b0．8±0．15bP74±4ab25±1b58±8b24±3b1．3±0．09b1．1±0．09bNP59±4b25±1b27±2c15±1b2．1±0．17a1．7±0．13a

每列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05,n=3),數(shù)據(jù)表示平均值±標準誤差;Vmax：最大酶促反應(yīng)速率,Maximum rate of enzyme reaction;Km：半飽和常數(shù),Michalis constant;Vmax/Km：酶促反應(yīng)效率,The efficiency of enzyme reaction；βG：β-1,4-葡萄糖苷酶,β-glucosidase；NAG：β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶,N-acetyl-glucosaminidase

圖3 土壤β-1,4-葡萄糖苷酶(βG)和β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(NAG)動力學(xué)參數(shù)Vmax、Km的相關(guān)性分析Fig.3 Relationships between the kinetics parameters (Vmax and Km) of β-glucosidase (βG) and N-acetyl-glucosaminidase (NAG)

2.4 主成分分析

2.5 相關(guān)分析

圖4 土壤碳氮礦化速率、土壤βG、NAG動力學(xué)參數(shù)和土壤環(huán)境因子主成分分析Fig.4 Principal component analysis of the soil carbon and nitrogen mineralization rates, βG and NAG kinetic parameters and soil environment factors(a)不同處理得分,(a) score of different treatment；(b)土壤Cmin、土壤Nmin、土壤βG、NAG動力學(xué)參數(shù)和環(huán)境因子載荷值,(b) loading values of individual soil carbon and nitrogen mineralization rate, βG kinetics and soil environmental factors；βGVmax：βG酶促反應(yīng)最大速率, Maximum rate of β-glucosidase；βGKm：βG米氏常數(shù),Michalis constant of β-glucosidase； NAG Vmax：NAG酶促反應(yīng)最大速率,Maximum rate of N-acetyl-glucosaminidase；NAGKm：NAG米氏常數(shù), Michalis constant of N-acetyl-glucosaminidase；Ka (βG): 土壤βG的催化效率Vmax/Km, efficient reaction of N-acetyl-glucosaminidase; Ka (NAG): 土壤NAG的催化效率Vmax/Km,The efficient reaction of N-acetyl-glucosaminidase

礦化MineralizationpHpH有機碳SOC全氮TN全磷TP可溶性碳DOC銨態(tài)氮NH+4-N硝態(tài)氮NO-3-N有效磷aP碳礦化速率Cmin0．262-0．2390．1380．0470．551?-0．189-0．01-0．187氮礦化速率Nmin0．635??-0．3720．1530．3670．215-0．459?-0．581?0．204氨化速率R氨0．530?-0．616?-0．456-0．161-0．045-0．329-0．421-0．187硝化速率R硝0．0500．2980．2920．639?-0．1050．166-0．1640．654?

*P<0.05,**P<0.01,n=20；Cmin：碳礦化速率,Carbon mineralization；Nmin：氮礦化速率,Nitrogen mineralization；R氨：氨化速率,Ammonification rate；R硝：硝化速率,Nitrifying rate

表4 βG、NAG動力學(xué)參數(shù)與土壤環(huán)境因子的相關(guān)性

*P<0.05,**P<0.01,n=12

3 討論

3.1 氮磷添加對土壤碳、氮礦化速率的影響

Cmin隨著培養(yǎng)時間的延長而降低,與Fang等[26]的研究結(jié)果一致,這是由于培養(yǎng)后期土壤中易分解的糖類和蛋白質(zhì)等物質(zhì)減少,難分解的木質(zhì)素、纖維素逐漸占主導(dǎo)地位,導(dǎo)致微生物對有機碳的利用效率降低[26]。本文表明N添加抑制土壤Cmin,這與Jussy等[7]的結(jié)果一致。N添加減少了杉木林中土壤微生物量及微生物群落的多樣性[27],導(dǎo)致土壤Cmin降低。文中P添加對土壤Cmin沒有明顯影響,主要因為在P素限制的亞熱帶森林地區(qū),外源P素輸入主要被植物吸收[28],對與Cmin有關(guān)的微生物影響較小。

3.2 氮磷添加對土壤水解酶動力學(xué)特征的影響

文中結(jié)果顯示,N添加增加了βG的Vmax,這與Stone等[31]的結(jié)論一致。N添加增加了土壤中氮素的有效性,導(dǎo)致碳素相對缺乏。根據(jù)微生物經(jīng)濟分配理論,此時微生物會產(chǎn)生更多與碳分解的酶,即增大碳水解酶的Vmax[31]。有研究結(jié)果表明Vmax、Km是米氏方程中兩個獨立的變量[16],本文研究結(jié)果也表明,N添加使βG的Vmax和Km同時增大(圖3),其原因可能是酶與有機物結(jié)合的有效位點受有機物有效性的限制,而輸入的氮素會與土壤中的含碳化合物形成復(fù)雜的有機體[32],降低了βG與底物的親和力,增加了土壤βG的Km[30]。本文結(jié)果表明,N添加并未增加βG的Vmax/Km(催化效率)(表2),說明N添加條件下,土壤微生物不是通過提高酶的Vmax/Km,而是通過提高酶的Vmax[31]來緩解由于N添加引起的碳限制。另外文中結(jié)果表明,N添加條件下的Cmin與βG的Vmax成反比,這是因為Cmin、Nmin大小不但受Vmax的影響,還與酶與底物的親和力常數(shù)Km有關(guān),Cmin、Nmin的大小Vmax/Km決定[18]。

P添加抑制了NAG的Vmax(表2),這與Wang等[33]的研究結(jié)果一致,原因可能是在較高的aP條件下微生物減少了NAG數(shù)量的產(chǎn)生[33]。也有研究認為,aP可以緩解微生物對N素的需求,從而降低了氮水解酶的活性[34]。P添加對βG的Vmax無明顯影響,這盡管與微生物經(jīng)濟分配理論不一致,但也和一些研究報道一致,例如Turner等[13]在亞熱帶的森林研究中發(fā)現(xiàn)持續(xù)10年的P添加對βG的Vmax無明顯影響。然而,文中結(jié)果顯示,NP同時添加明顯的增加βG和NAG的Vmax/Km(表2),這可能與NP同時添加降低了這兩種酶的Km,增加了酶與底物的親和力有關(guān)(表2)。

4 結(jié)論

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