廖 怡， 趙德蕊， 胡雪瑞， 吳家文

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院,合肥 230012； 2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 科研實(shí)驗(yàn)中心, 合肥 230038； 3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 合肥 230012； 4. 安徽道地藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心, 合肥 230038； 5. 安徽中醫(yī)藥科學(xué)院, 合肥 230038)

當(dāng)生物有機(jī)體受到環(huán)境中的應(yīng)激原(一般為熱刺激)刺激后，可以產(chǎn)生高度保守的防御性蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生對(duì)抗外界逆境因素的保護(hù)性反應(yīng)，這些防御性蛋白質(zhì)稱為熱應(yīng)激蛋白(heat stress proteins, HSPs)，又名熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)。一般根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量和同源程度將熱應(yīng)激蛋白分為HSP100家族、HSP90(83～90 ku)家族、HSP70(66～79 ku)家族、HSP60家族以及小分子HSP(15～30 ku)家族[1-2]。其中研究最深入的是HSP90和HSP70家族，他們具有高度保守性，在機(jī)體正常情況下低量表達(dá)，當(dāng)遇到外界不利因素的刺激后，可以大量表達(dá)。

熱應(yīng)激蛋白是進(jìn)化上高度保守、功能上至關(guān)重要和在生物體內(nèi)與抗逆緊密相關(guān)的一類存在于整個(gè)生物界(從低等原核到高等動(dòng)植物)的十分重要的蛋白質(zhì)[3]。

對(duì)動(dòng)物而言，高溫、低氧、創(chuàng)傷、重金屬離子等逆境因素可以誘導(dǎo)熱應(yīng)激蛋白的產(chǎn)生，以維護(hù)細(xì)胞生存和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。例如鮑恩東等[4]研究發(fā)現(xiàn)HSP70在急性熱應(yīng)激損傷的肉雞心肌纖維胞漿內(nèi)分布密集，說(shuō)明HSP70的含量高低對(duì)心肌組織功能有影響且在心肌纖維內(nèi)行使重要生理功能。Yu等[5]發(fā)現(xiàn)用2-去氧葡萄糖飼養(yǎng)的老鼠因缺血而引起缺氧時(shí)，HSP70的表達(dá)量會(huì)提高，從而減輕因低氧對(duì)機(jī)體的損傷，起到保護(hù)作用。Wang等[6]發(fā)現(xiàn)注射HSP47-反義脫氧核苷酸對(duì)手術(shù)創(chuàng)傷的新生鼠可有效抑制HSP47的表達(dá)及皮膚I型膠原的累積，且有效減輕創(chuàng)面愈合所需的膠原纖維紊亂。表明HSP47-反義脫氧核苷酸可能具有抑制皮膚瘢痕形成的治療潛力。沈驊等[7]發(fā)現(xiàn)鯽魚(yú)肝臟內(nèi)HSP70的誘導(dǎo)表達(dá)受重金屬離子Cu2+、Zn2+濃度的影響顯著，表明HSP70可作為重金屬污染物生物標(biāo)志物。

對(duì)植物而言，當(dāng)外界環(huán)境溫度比正常生長(zhǎng)溫度高10℃左右時(shí)，植物體內(nèi)就會(huì)有熱應(yīng)激蛋白的產(chǎn)生。植物熱應(yīng)激蛋白對(duì)植物在逆境脅迫下引起的傷害具有很大的減緩作用，是植物短期適應(yīng)逆境的必需組成成分，相關(guān)逆境因素如高溫、冷凍、干旱等均能誘發(fā)HSPs產(chǎn)生。陳忠等[8]發(fā)現(xiàn)高溫誘導(dǎo)豌豆幼苗中熱激蛋白Hpc60的產(chǎn)生對(duì)抗壞血酸過(guò)氧化物酶具有保護(hù)作用，表明高溫下植物產(chǎn)生的熱應(yīng)激蛋白可以對(duì)機(jī)體重要的酶或蛋白質(zhì)起保護(hù)作用從而使植物獲得耐熱性。近年的研究表明，在低溫刺激下，也能誘導(dǎo)HSPs的產(chǎn)生，例如HSPs和植物耐冷性的直接關(guān)系由Collins等[9]首先證實(shí)。雖然冷熱應(yīng)激在植物體內(nèi)屬于不同的反應(yīng)過(guò)程，但這兩種逆境都可以誘導(dǎo)熱應(yīng)激蛋白的表達(dá)。Coca等[10]研究發(fā)現(xiàn)向日葵受水分脅迫時(shí)小分子熱應(yīng)激蛋白HSPl7.6和HSPl7.9基因高表達(dá)，且體內(nèi)水分喪失程度與其mRNA表達(dá)水平呈正性相關(guān)。

以上研究均表明應(yīng)激蛋白的產(chǎn)生與生物外界逆境密切相關(guān)，研究應(yīng)激蛋白對(duì)探索降低逆境對(duì)動(dòng)植物的傷害和研究動(dòng)植物體內(nèi)重要的抗逆機(jī)制有著非常重要的理論和實(shí)踐意義。

中藥苦參(SophoraflavescentsAit)是一種有著悠久歷史的豆科槐屬植物。具有清熱燥濕，殺蟲(chóng)和利尿作用，在臨床上，它主要用于熱痢，便血，黃疸尿閉，赤白帶下，外陰腫脹瘙癢，濕疹，外治滴蟲(chóng)性陰道炎[11]。據(jù)報(bào)道，苦參具有多種藥理活性，如抗腫瘤[12]，抗菌，抗炎和鎮(zhèn)痛作用[13]。

本研究中，作者以苦參為研究對(duì)象首次克隆了苦參小分子量的應(yīng)激蛋白hsp17.8的編碼序列，在大腸桿菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)了體外表達(dá)，并進(jìn)一步對(duì)其理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等進(jìn)行了分析。

1 材料

1.1 植物材料、菌株與載體

新鮮苦參組織取自安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物園，由楊青山老師鑒定；大腸桿菌E．coliDH5α、表達(dá)載體pET22b(+)由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院施蘊(yùn)渝教授惠贈(zèng)；大腸桿菌E．coliBL21(DE3)、擴(kuò)增載體pMD19-T Vector分別購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司、TaKaRa公司。

1.2 各種酶、試劑及試劑盒

rTaqDNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶，DL2000 DNA Marker、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactoside, IPTG)，蛋白Marker均購(gòu)自TaKaRa公司。RNA提取試劑盒[E.Z.N.A Plant RNA Kit (50)]為OMEGA產(chǎn)品、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)購(gòu)自Thermo公司、質(zhì)粒小抽試劑盒[AxyPrepTMPlasmid miniprep Kit (50 prep)]和膠回收試劑盒[AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit (50 prep)]購(gòu)自Axygen Scientific公司。

2 方法

2.1 苦參RNA的提取及cDNA的合成

從-80℃超低溫冰箱取新鮮苦參葉片在液氮中充分研磨成粉末，用RNA提取試劑盒提取苦參總RNA，將提取的總RNA取2 μL用DEPC水稀釋1000倍，在酶標(biāo)儀(Microplate Reader)上測(cè)定260 nm、280 nm處的吸光度值(即光密度值OD), 計(jì)算剛剛提取的苦參總RNA濃度，并分析其純度；核酸電泳用來(lái)檢測(cè)苦參總RNA 的完整性。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書將經(jīng)檢測(cè)了的純度高完整性好的RNA用來(lái)合成cDNA。合成的cDNA保存于-20℃冰箱，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)華大基因公司測(cè)序的苦參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中篩選出hsp，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性的PCR引物來(lái)獲得hsp17.8的編碼序列。引物序列為H1:5′-CATATGATGGGAAAGGCACGCACCATTGG GGT-3′(下劃線為NdeⅠ的酶切位點(diǎn))，H2:5′-CTCGAGCTGCCTGGAATTGGAAGATTGGTTTCC-3′(下劃線為XhoⅠ的酶切位點(diǎn))，引物由上海生工生物公司合成。

2.3 PCR擴(kuò)增目的基因hsp17.8

以合成的cDNA為模板，設(shè)計(jì)的H1、H2為引物對(duì)hsp17.8進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系：ddH2O 16 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1 μL，引物H1和H2 (5 μmol/ L)各1 μL，cDNA 2 μL，rTaqDNA聚合酶(5 U/μL) 1.5 μL。PCR條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，40℃退火30 s，72℃延伸1 min，共10個(gè)循環(huán)；接著94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后在72℃下再延伸10 min。用核酸電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

2.4 pMD19T-hsp17.8擴(kuò)增質(zhì)粒的構(gòu)建

在紫外燈下用干凈的手術(shù)刀切下核酸膠中的目的DNA亮帶，此條帶用膠回收試劑盒純化(純化結(jié)果用核酸電泳檢測(cè))，然后在16℃水浴下連接到pMD19-T Vector，連接體系：回收純化的DNA 11 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 1.5 μL，pMD19-T Vector 1.5 μL和T4 DNA Ligase 1 μL。用42℃，90 s熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到實(shí)驗(yàn)室新制備的感受態(tài)細(xì)胞E．coliDH5α，先預(yù)培養(yǎng)1.5 h再涂布于Amp+的LB平板。次日，挑單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定，PCR體系和條件同上。同時(shí)用質(zhì)粒小抽試劑盒制備重組質(zhì)粒，為接下來(lái)的NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切做準(zhǔn)備，雙酶切在37℃水浴下進(jìn)行，體系為：Plasmid DNA 30 μL，10×H Buffer 3.8 μL，NdeⅠ 2 μL，XhoⅠ 2 μL。用核酸電泳檢測(cè)是否出現(xiàn)目的條帶。陽(yáng)性菌液送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2.5 pET22b-hsp17.8表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將陽(yáng)性重組擴(kuò)增載體pMD19T-hsp17.8雙酶切后的帶有酶切位點(diǎn)的目的片段切割回收純化，與經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切的表達(dá)載體 pET22b(+)于16℃連接過(guò)夜。連接體系為：回收純化的帶有酶切位點(diǎn)的DNA 9.5 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 1.5 μL，pET22b(+) 3 μL和T4 DNA Ligase 1.2 μL。轉(zhuǎn)化、挑單克隆、菌液PCR鑒定、質(zhì)粒抽提、NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定操作同上。用核酸電泳檢測(cè)是否出現(xiàn)目的條帶。陽(yáng)性克隆送測(cè)序分析(上海生工生物技術(shù)有限公司)。

2.6 重組表達(dá)菌的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-hsp17.8轉(zhuǎn)化E．coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆于37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將震蕩過(guò)夜培養(yǎng)的原核表達(dá)菌取3 mL接種到200 mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基里，37℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600=0.6左右時(shí)，加入IPTG使其終濃度為0、0.1、0.5和1 mmol/L(其中0 mmol/L為不添加 IPTG的對(duì)照組)，將其分別在3個(gè)溫度(16℃、25℃和37℃)下誘導(dǎo)表達(dá)24 h、8 h和6 h，轉(zhuǎn)速為150 r/min。由于大腸桿菌在16℃、24h，25℃、8 h和37℃、6 h均達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期，延長(zhǎng)時(shí)間蛋白質(zhì)表達(dá)量不再增加，所以我們選擇了這些參數(shù)作為誘導(dǎo)蛋白產(chǎn)生的條件；高濃度的IPTG有毒性，會(huì)殺死細(xì)胞，且會(huì)增加外源蛋白表達(dá)速度，容易造成包涵體的形成，所以一般選擇IPTG終濃度為0.1～1 mmol/L，我們選擇了IPTG最小終濃度0.1 mmol/L和最大終濃度1 mmol/L以及它們的中間濃度0.5 mmol/L作為實(shí)驗(yàn)組，以0 mmol/L為對(duì)照組，對(duì)熱應(yīng)激蛋白的表達(dá)量做了比較。誘導(dǎo)結(jié)束后，8000 r/min 離心25 min收集菌體，用30 mL PBS(含500 mmol/L NaCl)/300 μL PMSF混勻收集的細(xì)菌，樣品放置冰上保持低溫，超聲(超聲1 s，停頓3 s，破碎次數(shù)共120次)將細(xì)菌完全破碎裂解。13 000 r/min離心30 min收集上清。樣品分別加入相應(yīng)量的5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，95℃煮沸5 min，進(jìn)行后續(xù)的Western blot檢測(cè)。

2.7 Western blot

制備15%分離膠和5%濃縮膠，加樣，75V電泳30 min后切換115 V電泳90 min，電泳結(jié)束后切膠，轉(zhuǎn)膜、封閉、附一抗His-Tag 抗體 (1/1000)過(guò)夜、洗膜、附二抗anti-mouse IgG HRP(1/2500)、洗膜、曝光。

2.8 生物信息學(xué)分析

首先用在線翻譯工具(https://www.bioinformatics.org/sms2/translate.html)對(duì)hsp17.8進(jìn)行基因序列翻譯，接下來(lái)用在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)HSP17.8蛋白的等電點(diǎn)、分子質(zhì)量等物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。HSP17.8蛋白的潛在功能位點(diǎn)使用Motif scan (http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan/)進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用SMART BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/smartblast/smartBlast.cgi)工具對(duì)HSP17.8進(jìn)行同源序列的搜索，基于BLAST搜索結(jié)果用BoxShade Server (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)、Clustalx1.83和MEGA5.0軟件對(duì)HSP17.8進(jìn)行同源蛋白的比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析。利用在線蛋白折疊識(shí)別工具PHYRE2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對(duì)HSP17.8的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和模擬，用PyMOL program軟件對(duì)HSP17.8蛋白的3D模型進(jìn)行繪制。

3 結(jié)果與分析

3.1 苦參RNA的提取鑒定

從新鮮苦參葉片中提取的RNA經(jīng)超純水稀釋1000倍，在酶標(biāo)儀上測(cè)定其OD在260 nm和280 nm處的值，計(jì)算OD260/OD280的比值為1.92，結(jié)果在1.8和2.0之間，說(shuō)明提取的RNA純度較好；同時(shí)對(duì)新提取的苦參總RNA進(jìn)行核酸電泳檢測(cè)，紫外燈下顯示所提RNA有3條可見(jiàn)的明亮條帶，說(shuō)明苦參RNA的完整性較好。雙重檢測(cè)的RNA基本無(wú)降解，可以用來(lái)合成cDNA (圖未顯示)。

3.2 目的基因hsp17.8的PCR鑒定

以合成的苦參cDNA為模板，H1、H2為引物，用rTaqDNA聚合酶做兩步PCR。PCR結(jié)果如圖1-A所示，凝膠上有分子質(zhì)量在500 bp左右的明亮條帶，表明得到了預(yù)期大小的hsp17.8目的條帶。

3.3 pMD19T-hsp17.8擴(kuò)增質(zhì)粒的鑒定

將核酸膠上的hsp17.8目的條帶切割下來(lái)純化濃縮，與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化入實(shí)驗(yàn)室新制備感受態(tài)細(xì)胞E．coliDH5α培養(yǎng)，用菌液PCR和NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切對(duì)培養(yǎng)的重組菌進(jìn)行雙重鑒定，結(jié)果如圖1-B和1-C所示，在分子質(zhì)量500 bp左右處均出現(xiàn)清楚的目的條帶，說(shuō)明pMD19T-hsp17.8擴(kuò)增質(zhì)粒構(gòu)建成功。生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序結(jié)果比對(duì)顯示此序列與苦參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)里的序列(TR2941)完全匹配。

3.4 pET22b-hsp17.8表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

將經(jīng)過(guò)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切的pET22b(+)和同樣經(jīng)過(guò)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切的目的基因用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入實(shí)驗(yàn)室新制備的感受態(tài)細(xì)胞E．coliDH5α，取單個(gè)克隆進(jìn)行菌液PCR和NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切雙重鑒定，結(jié)果如圖1-D和1-E所示，在分子質(zhì)量500 bp左右處也均出現(xiàn)清楚的目的條帶，說(shuō)明pET22b-hsp17.8表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)生工生物技術(shù)有限公司再次測(cè)序，結(jié)果顯示此序列與上次測(cè)序結(jié)果完全匹配。

圖1 hsp17.8的克隆與重組載體的構(gòu)建

A：hsp17.8的PCR擴(kuò)增；B：含有pMD19T-hsp17.8重組質(zhì)粒的菌液PCR；C：pMD19T-hsp17.8重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果；D：含有pET22b-hsp17.8重組質(zhì)粒的菌液PCR；E：pET22b-hsp17.8重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果。箭頭示意目的條帶

3.5 Western blot結(jié)果分析

將上述重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-hsp17.8轉(zhuǎn)入E．coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。在不同溫度、時(shí)間下用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，其蛋白表達(dá)情況通過(guò)Western blot檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2-A所示，在分子質(zhì)量約17.8 ku處有明顯的條帶，與理論分子質(zhì)量值相符，蛋白在上清中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于沉淀中的表達(dá)量(沉淀蛋白表達(dá)圖片未顯示)，說(shuō)明此蛋白為可溶性蛋白。基于Western blot檢測(cè)結(jié)果，用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)HSP17.8表達(dá)量進(jìn)行繪圖分析，如圖2-B顯示，在溫度為16℃、IPTG終濃度為1 mmol/L，25℃、IPTG終濃度為0.5 mmol/L和37℃、IPTG終濃度為0.1 mmol/L條件下，HSP17.8蛋白表達(dá)量比較高，但總體比較結(jié)果是：在25℃、0.5 mmol/L IPTG條件下，苦參HSP17.8蛋白的表達(dá)量最高(*表示)，因此25℃、終濃度為0.5 mmol/L IPTG是HSP17.8的最佳體外表達(dá)條件。

圖2 熱應(yīng)激蛋白HSP17.8的誘導(dǎo)表達(dá)情況及表達(dá)量的分析

A：Western blot結(jié)果(M為蛋白Marker；1、2、3、4代表在16℃下IPTG終濃度為0、0.1、0.5和1 mmol/L時(shí)的蛋白表達(dá)情況；5、6、7和8代表在25℃下IPTG終濃度為0、0.1、0.5和1 mmol/L時(shí)的蛋白表達(dá)情況；9、10、11和12代表在37℃下IPTG終濃度為0、0.1、0.5和1 mmol/L時(shí)的蛋白表達(dá)情況)。B：HSP17.8蛋白表達(dá)量的分析(*標(biāo)示了最高表達(dá)量)

3.6 生物信息學(xué)分析

3.6.1 HSP17.8蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)分析

將HSP17.8編碼序列用在線工具(The Sequence Manipulation Suite)翻譯成氨基酸，再將氨基酸序列通過(guò)ProtParam (ExPaSy)軟件分析得到HSP17.8蛋白的分子質(zhì)量、分子式、等電點(diǎn)、電荷性等一系列物理化學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如下表1所示。此蛋白的不穩(wěn)定性指數(shù)為26.44 (小于40)，說(shuō)明此蛋白很穩(wěn)定，不容易降解；它的總平均親水性為-0.066，屬于負(fù)值，說(shuō)明此蛋白為親水性蛋白，與Western blot結(jié)果顯示一致，即為可溶性蛋白。

3.6.2 HSP17.8蛋白的潛在功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)

Motif Scan分析HSP17.8蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)一個(gè)3-磷酸甘油醛脫氫酶、輔酶結(jié)合域、3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)N-蛋白質(zhì)豆蔻?；稽c(diǎn)、3個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，具體位置見(jiàn)表2；且K3-K157氨基酸序列與兩個(gè)應(yīng)激蛋白非常相似，E值分別為3e-19和9.3e-19，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于10-6，說(shuō)明此蛋白與應(yīng)激蛋白同源性非常高，應(yīng)該屬于應(yīng)激蛋白家族中的一員。

表1 HSP17.8蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)

3.6.3 HSP17.8同源序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)SMART BLAST在線軟件分析，根據(jù)蛋白的同源性在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到HSP17.8蛋白相似度最高的13個(gè)同源蛋白，它們的序列號(hào)分別為大豆(Glycinemax)，NP_001237890.1；羽扇豆(Lupinusangustifolius)，XP_019459376.1；木豆(Cajanuscajan)，XP_020234148.1；豇豆(Vignaradiatavar.radiate)，XP_014504733.1；野生大豆(Glycinesoja)，KHN39491.1；蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)，XP_003616191.1；赤豆(Vignaangularis)，XP_017430444.1；赤豆(Vignaangularis)，XP_017430443.1；菜豆(Phaseolusvulgaris)，XP_007141947.1；地三葉草(Trifoliumsubterraneum)，GAU36776.1；蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)，XP_013454197.1；百脈根(Lotusjaponicas)，AFK43932.1；大豆(Glycinemax)，KRH72936.1。發(fā)現(xiàn)苦參HSP17.8與各種豆類的HSP同源性較高，這與苦參屬于豆科植物是一致的。用在線軟件BoxShade Server 和Clustalx1.83對(duì)HSP17.8及其相似度最高的13個(gè)同源蛋白進(jìn)行比對(duì)，如圖3-A所示。使用MEGA5.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining Method, NJ)，步長(zhǎng)值(Bootstrap values)設(shè)為1000的重復(fù)性對(duì)HSP17.8及其13個(gè)同源蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，如圖3-B所示，苦參的HSP17.8與羽扇豆的應(yīng)激蛋白在同一個(gè)子分支中，相似度達(dá)到了90%，說(shuō)明苦參與羽扇豆的應(yīng)激蛋白同源性最高，兩物種之間的親緣關(guān)系最近。

3.6.4 苦參HSP17.8的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬

通過(guò)PHYRE2在線軟件，以得分最高的d1mjha為模板，獲得了HSP17.8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息及三維結(jié)構(gòu)模型(圖4)，氨基酸序列覆蓋率為86% (覆蓋HSP17.8的142個(gè)氨基酸殘基，它們分別為1M、4A-45A、63L-161S)，序列一致性為28%，可信度為99%。圖4-A結(jié)果顯示HSP17.8具有4個(gè)α螺旋(15A-27N、62P-93T、109E-114E、140S-148N)、5個(gè)β折疊(6T-10A、Q34-40V、97V-105G、121D-124V、153V-156V)。用三級(jí)結(jié)構(gòu)繪圖軟件PyMOL對(duì)HSP17.8蛋白的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行繪制，如圖4-B所示，可以看出HSP17.8蛋白富含α螺旋和β折疊，α螺旋和β折疊依次出現(xiàn)，形成了β1-α1-β2-α2-β3-α3-β4-α4-β5的折疊方式，5個(gè)β折疊相同方向，被α螺旋包裹在內(nèi)部，構(gòu)成了蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的內(nèi)部框架。

表2 HSP17.8蛋白的潛在功能位點(diǎn)

圖3苦參HSP17.8的同源蛋白比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

Fig 3 Homologous alignment and phylogenic tree of HSP17.8

A：HSP17.8與13個(gè)同源性最高的蛋白比對(duì)圖。B：HSP17.8的進(jìn)化關(guān)系圖(0.02表示遺傳距離；枝干數(shù)字表示分支支持率)

4 討論

植物小分子熱激蛋白(small heat shock proteins, sHSP)在植物受到逆境脅迫下表達(dá)量明顯增加，提高了植物對(duì)各種逆境因子脅迫的防御能力，是一類重要的脅迫誘導(dǎo)蛋白[14]，被認(rèn)為是植物抗逆過(guò)程中的第一道防線[15]。劉箭等[16]利用Northern雜交法發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下，番茄花藥中細(xì)胞質(zhì)和線粒體sHSP基因轉(zhuǎn)錄明顯，認(rèn)為sHSP基礎(chǔ)含量的增加可減緩快速升溫對(duì)熱敏性花藥的傷害。Lund等[17]研究結(jié)果表明，在熱激誘導(dǎo)下玉米線粒體小分子HSP22相比大分子HSP70含量發(fā)生了明顯變化，認(rèn)為線粒體小分子熱應(yīng)激蛋白HSP22在分子水平、蛋白質(zhì)水平和細(xì)胞器水平上對(duì)植物主要起保護(hù)功能，直接影響植物線粒體耐熱性。Sun等[18]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的At-HSP17.6A能夠提高擬南芥的耐鹽性和抗旱性，說(shuō)明sHSP對(duì)逆境生理研究有著重要意義。

圖4 HSP17.8的二級(jí)結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)型圖

A：苦參HSP17.8的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖(1、2、3、4分別代表預(yù)測(cè)的HSP17.8二級(jí)結(jié)構(gòu)、HSP17.8的氨基酸序列、模板d1mjha的氨基酸序列、模板d1mjha的已知二級(jí)結(jié)構(gòu)；綠色螺旋狀為α螺旋，淺藍(lán)色箭頭為β折疊)。B：苦參HSP17.8的3D模型圖(黃色箭頭表示β折疊；紅色螺旋表示α螺旋；綠色為無(wú)規(guī)卷曲；N-terminal為HSP17.8蛋白的氨基末端；C-terminal為HSP17.8蛋白的羧基末端)

基于sHSP的重要的生物學(xué)功能及其巨大的應(yīng)用潛力，作者利用分子生物學(xué)手段首次從苦參中克隆了長(zhǎng)度為498 bp的熱應(yīng)激蛋白小分子家族HSP17.8基因，其編碼166個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為MF101468，并成功在體外誘導(dǎo)其表達(dá)，該蛋白分子質(zhì)量約為17.8 ku，等電點(diǎn)為8.55，是穩(wěn)定親水性蛋白。我們進(jìn)一步篩選了其最佳的體外誘導(dǎo)表達(dá)條件，分析了該蛋白的理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系以及空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等，發(fā)現(xiàn)該蛋白與羽扇豆的應(yīng)激蛋白同源性達(dá)到了90%，親緣關(guān)系最近，這與苦參是豆科植物是一致的。本研究為今后探索植物小分子熱激蛋白的誘導(dǎo)機(jī)理、結(jié)構(gòu)功能以及在植物體內(nèi)的抗逆機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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