默立賓, 李長(zhǎng)紅, 陳 炯

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

熱應(yīng)激蛋白(heat shock proteins, HSPs)是指細(xì)胞在不利環(huán)境因素刺激原特別是高溫環(huán)境下誘導(dǎo)生成的一類特殊蛋白質(zhì)。HSPs結(jié)構(gòu)高度保守, 廣泛存在于生物體內(nèi)。根據(jù)序列特征及典型分子質(zhì)量大小, 脊椎動(dòng)物的HSPs被分為3個(gè)大的家族, 包括小HSPs(16～24 ku)、HSP70(68～73 ku)和HSP90(85～90 ku)[1-2]。HSP是一個(gè)多功能蛋白, 當(dāng)環(huán)境發(fā)生異常變化時(shí), HSPs通過阻止非天然蛋白的聚合、促進(jìn)新合成蛋白的折疊、穩(wěn)定和復(fù)性受損蛋白以及促進(jìn)非天然或聚合蛋白進(jìn)入降解途徑等方式發(fā)揮細(xì)胞防御功能[3]。HSP90家族廣泛表達(dá), 非應(yīng)激條件下, 約占細(xì)胞內(nèi)總蛋白的1%～2%[4]。目前, HSP90家族蛋白主要分為4類, 包括2個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)的HSP90AA(也稱HSP90α或可誘導(dǎo)型)和HSP90AB(也稱HSP90β或組成型)亞型、位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的HSP90B亞型Grp94 (葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94, 94 ku glucose-regulated protein)以及位于線粒體基質(zhì)的HSP90同系物TRAP1(腫瘤壞死因子調(diào)節(jié)蛋白1, tumor necrosis factor receptor-associated protein-1)[5-6]。

越來越多的研究揭示, HSP90與環(huán)境脅迫密切相關(guān), 主要表現(xiàn)為不同環(huán)境因子下HSP90被不同程度地誘導(dǎo)表達(dá)或抑制表達(dá)。例如，高溫脅迫[7-10]、鹽度脅迫[7, 11]、食物缺乏[12]、低氧脅迫[13]、有機(jī)物污染[14]、砷酸鹽[15]、重金屬[14, 16-17]以及病原微生物感染[10, 18-19]等均能對(duì)HSP90表達(dá)產(chǎn)生影響。因此，HSP90有望被開發(fā)為環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域新的生物標(biāo)記分子。目前,HSP90已在包括大西洋鮭(Salmosalar)[7]、草魚(Ctenopharyngodonidella)[9]、鮸魚(Miichthysmiiuy)[10]、史氏鱘(Acipenserschrenckii)[13]、塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)[20]和團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[21]等在內(nèi)的數(shù)種魚類中得到克隆及鑒定。

香魚(Plecoglossusaltivelis, ayu)隸屬胡瓜魚目香魚科, 是東亞地區(qū)中國(guó)、日本和朝鮮等國(guó)特有的小型名貴經(jīng)濟(jì)魚類。在浙江, 野生香魚主要分布于象山港以南的浙江中部和南部的河川溪流中, 其中寧海鳧溪和南北雁蕩山等地的尤為著名[22]。香魚對(duì)環(huán)境水質(zhì)的要求極高, 尤其對(duì)水體污染高度敏感, 可作為反映地方生態(tài)環(huán)境的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究擬對(duì)香魚HSP90β(PaHSP90β)進(jìn)行研究, 明確其序列、結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系及mRNA組織分布, 并通過測(cè)定重金屬及鹽度脅迫對(duì)其 mRNA表達(dá)的影響, 分析PaHSP90β與環(huán)境適應(yīng)的相關(guān)性, 為進(jìn)一步研究香魚在抵抗環(huán)境變化方面的分子作用機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

健康香魚購(gòu)自浙江寧海縣鳧溪陳家香魚養(yǎng)殖場(chǎng), 體重20～30 g, 暫養(yǎng)于充分曝氣的自來水中, 水溫(20±1)℃。大腸桿菌(Escherichiacoli) TG1由實(shí)驗(yàn)室保存; T4DNA連接酶、pMD19-T Simple Vector、LATaqDNA聚合酶、RNAiso Reagent、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和SYBRPremixExTaq試劑盒等購(gòu)自TaKaRa公司(日本); Gel Extraction Kit購(gòu)自O(shè)mega公司(美國(guó))。引物合成、測(cè)序由英維捷基貿(mào)易有限公司(上海)完成。

1.2 PaHSP90β cDNA序列獲得及序列分析

從香魚肝cDNA文庫(kù)中獲得PaHSP90βcDNA序列, 并通過PCR擴(kuò)增、TA克隆和序列測(cè)定進(jìn)行驗(yàn)證。同源蛋白序列比對(duì)采用BLASTP 軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), 蛋白分子質(zhì)量大小及等電點(diǎn)預(yù)測(cè)采用Compute pI/Mw程序 (http://web.expasy.org/compute_pi/), 信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)采用SignalP 4.1軟件 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)采用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)和PROSITE軟件(http://kr.expasy.org/prosite/)。多重序列比對(duì)采用ClustalW軟件(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/), 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建采用MEGA 5.0軟件[23]。氨基酸多重序列比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建所用序列詳見表1。

表1 多重比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建采用序列

注：a和b分別表示虹鱒HSP90β的2個(gè)亞型；下同

1.3 健康香魚樣品采集

暫養(yǎng)2周后, 隨機(jī)選取 5 尾香魚, 分別取肝、脾、腎、腦、心、鰓、肌肉和腸8個(gè)組織,分別置于1.5 mL離心管中并立即投入液氮中, 全部收集完畢后轉(zhuǎn)存-70℃超低溫冰箱保存。

1.4 香魚鎘脅迫

實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組和鎘脅迫組, 對(duì)照組香魚飼養(yǎng)于無鎘的曝氣自來水中, 鎘脅迫組以5.0 mg/L的鎘濃度蓄養(yǎng)香魚[24]。實(shí)驗(yàn)開始后分別于4、8、12和24 h采集兩組香魚的肝、脾、腎、鰓和腸等組織樣品, 每組每次取4尾香魚。組織收集方法同上。

1.5 香魚鹽度脅迫

實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組和鹽度脅迫組, 對(duì)照組香魚飼養(yǎng)于曝氣自來水中, 鹽度脅迫組香魚在淡水中暫養(yǎng)2 周后, 采用3 d 內(nèi)逐步升高鹽度的方式到達(dá)指定鹽度10‰[25]。實(shí)驗(yàn)開始后于7、14和21 d時(shí)分別取兩組香魚的肝、脾、腎、鰓和腸等組織樣品。組織收集方法同上。

1.6 不同組織中PaHSP90β mRNA的表達(dá)

采用qPCR分析健康香魚不同組織中PaHSP90βmRNA的表達(dá), 鎘脅迫以及鹽度脅迫后不同時(shí)間點(diǎn)PaHSP90β在各組織中轉(zhuǎn)錄水平的變化?？俁NA的抽提、DNase I處理、第一鏈cDNA的合成及qPCR檢測(cè)參考黃左安等[26]的方法進(jìn)行。根據(jù)獲得的PaHSP90β全序列設(shè)計(jì)qPCR引物, 引物序列如下：PaHSP90β(+): 5′-TGACAAAGCGGTGAAGGACT-3′和PaHSP90β(-): 5′-TTAGTCCACTTCCTCCATGC-3′, 預(yù)期擴(kuò)增片段為240 bp。以香魚β-actin作為內(nèi)參[27],β-actin登錄號(hào)為AB020884。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次, 包括PaHSP90β和β-actin。利用相對(duì)熒光定量PCR法[28]對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，分析各樣本PaHSP90βmRNA的相對(duì)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 以P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PaHSP90β cDNA序列分析

PaHSP90βcDNA序列長(zhǎng)2726 bp(GenBank登錄號(hào)為：KY073361)，包括一個(gè)完整ORF，起始于第114～116 位的一個(gè)起始密碼子ATG，終止于2286～2288位的一個(gè)終止密碼子TAA，預(yù)測(cè)編碼1個(gè)含有724個(gè)氨基酸、分子質(zhì)量約為83.30 ku的蛋白，理論等電點(diǎn)為4.83，N-末端無信號(hào)肽序列(圖1)。對(duì)香魚及其他魚類的HSP90β氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)均具有HSP90 家族的5個(gè)保守信號(hào)區(qū)(圖1，分別標(biāo)記為Ⅰ～Ⅴ)。根據(jù)SMART 軟件推測(cè)，PaHSP90β在34～188處具有HATPase(histidine kinase-like ATPases)結(jié)構(gòu)域(圖1)。通過PROSITE工具預(yù)測(cè)，PaHSP90β在32～41位存有HSP90蛋白家族信號(hào)(Heat shock hsp90 proteins family signature) YsNKEIFLRE(圖1)。

序列分析表明, PaHSP90β與其他魚類HSP90β具有較高的氨基酸序列同源性 (89.7%～95.8%), 其中與白鮭HSP90β同源性最高, 達(dá)95.8%, 其次是虹鱒HSP90β亞型a, 同源性為95.3%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明, 哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類的HSP90β分別成簇, PaHSP90β位于魚類HSP90β簇中, 且與白鮭、大西洋鮭及虹鱒形成一個(gè)小簇, 與白鮭HSP90β進(jìn)化相關(guān)性最高(圖2)。

圖2 基于鄰接法構(gòu)建各物種全長(zhǎng)HSP90β氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

分支上數(shù)值為重復(fù)抽樣1000次得到的置信度, 僅大于60%的顯示；標(biāo)尺表示每一位點(diǎn)發(fā)生0.1次置換；各物種全長(zhǎng)HSP90β氨基酸序列的登錄號(hào)見表1

2.2 PaHSP90β mRNA組織差異表達(dá)特征

QPCR檢測(cè)結(jié)果表明, 健康香魚PaHSP90βmRNA在肝中表達(dá)量最豐富, 其次是脾, 在腎、腦、心、鰓和腸中表達(dá)量相對(duì)較少, 在肌肉中表達(dá)量微弱(圖3)。

圖3 健康香魚PaHSP90β mRNA的組織表達(dá)特征

1～8分別為：肝臟、脾、腎、腦、心、鰓、肌肉和腸；以PaHSP90β與β-actinmRNA的比值作為PaHSP90βmRNA的相對(duì)表達(dá)量；n=5

2.3 鎘脅迫對(duì)香魚各組織PaHSP90β mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，鎘處理4 h時(shí)，肝、脾、腎、鰓和腸中PaHSP90βmRNA的表達(dá)量顯著增加，分別為對(duì)照組的15.51、2.39、8.70、1.68和7.17倍(P<0.05)；在8 h時(shí)，肝PaHSP90βmRNA表達(dá)量開始降低，但仍顯著高于對(duì)照組，腎、鰓和腸中PaHSP90βmRNA表達(dá)量達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的33.23、5.73和13.80倍(P<0.05)；在12 h，肝中PaHSP90βmRNA表達(dá)量繼續(xù)降低，在24 h時(shí)與對(duì)照組無明顯差異，腎和腸中PaHSP90βmRNA仍顯著高于對(duì)照組，鰓中PaHSP90βmRNA表達(dá)量與對(duì)照組無明顯差異，脾中PaHSP90βmRNA顯著高于對(duì)照組，為對(duì)照組的2.55倍(P<0.05)(圖4)。

圖 4 鎘脅迫對(duì)香魚各個(gè)組織PaHSP90β mRNA表達(dá)的影響

A：肝; B：脾; C：腎; D：鰓; E：腸。以PaHSP90β與β-actinmRNA的比值作為PaHSP90βmRNA的相對(duì)表達(dá)量。*：與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)；n=4

2.4 鹽度脅迫對(duì)香魚各組織PaHSP90β mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，鹽度脅迫7 d時(shí)，肝、脾、腎和鰓中PaHSP90βmRNA的表達(dá)量顯著增加，分別為對(duì)照組的2.28、3.8、2.63和1.68倍(P<0.05)；在14 d時(shí)，肝PaHSP90βmRNA表達(dá)量開始降低，21 d時(shí)與對(duì)照組無明顯差異，而脾和腎中PaHSP90βmRNA表達(dá)量繼續(xù)增加，達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的4.73和4.81倍(P<0.05)，然后開始降低，21 d時(shí)脾PaHSP90βmRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比無明顯差異，但腎PaHSP90βmRNA表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組，為對(duì)照組的2.25倍；在14 d時(shí)，鰓中PaHSP90βmRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，為對(duì)照組的2.36倍，21 d時(shí)與對(duì)照組相比均無明顯差異。在整個(gè)脅迫期間，腸中PaHSP90βmRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比差異均不顯著(圖5)。

3 討論

HSP90家族蛋白結(jié)構(gòu)高度保守, 廣泛表達(dá), 非應(yīng)激條件下呈組成型表達(dá), 除具有“分子伴侶”(molecular chaperones)重要的“細(xì)胞管家”作用, 還參與協(xié)同免疫、調(diào)控細(xì)胞凋亡、應(yīng)激損傷和炎癥保護(hù)等生理過程。本文通過香魚肝cDNA文庫(kù)測(cè)序獲得了PaHSP90β全長(zhǎng)cDNA序列。氨基酸序列分析顯示, PaHSP90β與白鮭HSP90β同源性最高, 達(dá)95.8%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明, 哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類的HSP90β分別成簇, PaHSP90β位于魚類HSP90β簇中, 與白鮭HSP90β進(jìn)化相關(guān)性最高。

圖5 鹽度脅迫對(duì)香魚各個(gè)組織PaHSP90β mRNA表達(dá)的影響

A：肝; B：脾; C：腎; D：鰓; E：腸。以PaHSP90β與β-actinmRNA的比值作為PaHSP90βmRNA的相對(duì)表達(dá)量; *：與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)；n=4

組織表達(dá)特征分析顯示,PaHSP90β在健康香魚被檢組織中表達(dá)水平不同, 在肝中表達(dá)量最高, 與已報(bào)道的鮸魚[10]、史氏鱘[13]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[16]和唐魚(Tanichthysalbonubes)[17]等物種研究結(jié)果較為一致, 但與草魚[29]等魚類研究結(jié)果有較大差異。草魚HSP90β在性腺、心臟和鰓組織中表達(dá)量均較高, 其次是肝、脾和腦。HSP90β在魚類中不同的表達(dá)模式, 提示其可能參與魚類多種生理過程。

在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)中, A6腎上皮細(xì)胞經(jīng)10～20 μmol/L氯化鎘處理2 h,HSP90βmRNA的表達(dá)無明顯變化[30]; 在鯉魚中, 10 mg/L鎘脅迫96 h內(nèi), 腎中HSP90βmRNA的表達(dá)均無明顯變化[16]; 在唐魚中, 1.15和2.31mg/L鎘在脅迫72 h和96 h時(shí)均顯著抑制肝中HSP90βmRNA的表達(dá)[17]。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果有明顯差異。本研究中, 香魚經(jīng)鎘脅迫4～24 h內(nèi), 肝、脾、腎、鰓和腸等組織中PaHSP90βmRNA表達(dá)量顯著增加, 且在不同時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值。造成這種差別的原因, 可能由于物種本身的差異, 也可能由于脅迫方式、鎘濃度及取樣時(shí)間點(diǎn)不同所致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 香魚經(jīng)10‰鹽度脅迫后, 各組織中PaHSP90β的表達(dá)總體呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì), 與Pan等和Yang等的研究結(jié)果相似[7, 11]。Pan等研究發(fā)現(xiàn)[7], 大西洋鮭從淡水中轉(zhuǎn)至海水(30‰～35‰)中馴化養(yǎng)殖24 h后, 鰓片中HSP90βmRNA的表達(dá)量顯著上調(diào), 腎組織中HSP90βmRNA的表達(dá)無明顯變化; 在體外實(shí)驗(yàn)中, 鰓片和腎組織經(jīng)125 mmol/L氯化鈉處理12 h后, 鰓片和腎組織中HSP90βmRNA的表達(dá)模式與整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。Yang等研究發(fā)現(xiàn), 吳郭魚(Poecilialatipinna)從半咸水(15‰)轉(zhuǎn)至海水(35‰)中馴化養(yǎng)殖4周后, 肝和鰓中HSP90蛋白的表達(dá)量均顯著上調(diào)[11]。綜上, 魚類HSP90的表達(dá)與重金屬以及鹽度脅迫密切相關(guān), 推測(cè)可能由于重金屬或鹽度脅迫引起機(jī)體內(nèi)發(fā)生蛋白質(zhì)損傷, 從而誘導(dǎo)具有“分子伴侶”功能的HSP90表達(dá)增加, 以增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞對(duì)重金屬或氯化鈉的耐受性。然而, 具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究測(cè)定了香魚PaHSP90βcDNA序列, 序列分析揭示其與白鮭HSP90β序列最相似。健康香魚中,PaHSP90βmRNA在肝中表達(dá)量最豐富; 鎘脅迫后, 香魚肝、脾、腎、鰓和腸中PaHSP90βmRNA表達(dá)量顯著上調(diào), 鹽度脅迫后, 除腸組織外, 其他組織中PaHSP90βmRNA表達(dá)量總體上調(diào)，揭示HSP90β與重金屬及鹽度脅迫密切相關(guān), 可能作為環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域新的生物標(biāo)記分子。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究魚類HSP90的功能及其在環(huán)境脅迫中的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。

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