謝學(xué)文 張自心 武 軍 石延霞 柴阿麗 李寶聚

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）

黃瓜（Cucumis sativusL.）是我國(guó)重要的蔬菜作物之一，種植面積居世界首位，且逐年增加。近幾年，由多主棒孢（Corynespora cassiicola）侵染引起的黃瓜棒孢葉斑病成為危害我國(guó)黃瓜生產(chǎn)的重要新流行病害（李寶聚 等，2008；韓小爽 等，2011；楊雙娟 等，2012），危害范圍和程度甚至超過(guò)霜霉病和白粉病。該菌寄主范圍廣泛，能夠侵染逾530種植物。國(guó)內(nèi)外有關(guān)該病菌的研究主要集中在生物學(xué)特性、遺傳穩(wěn)定性和抗藥性等方面（Dixon et al.，2009；Miyamoto et al.，2010；高葦 等，2012；李寶聚 等，2012；D é on et al.，2014），對(duì)多主棒孢致病機(jī)理及侵染途徑方面研究較少。

紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）最早從印度洋-太平洋地區(qū)的珊瑚蟲(chóng)中分離而得，在不同溫度和pH條件下具有較高的穩(wěn)定性，且與其他蛋白形成的融合蛋白通常仍具有熒光，因其具有易于檢測(cè)、熒光穩(wěn)定、無(wú)毒害、種屬通用、易于構(gòu)建載體、可進(jìn)行活細(xì)胞定位定時(shí)觀察等特性而得到廣泛關(guān)注（Lorang et al.，2001）。RFP隨機(jī)插入真菌基因組中，可直觀、快速、簡(jiǎn)便地動(dòng)態(tài)觀察真菌定殖及其與寄主的互作機(jī)制（de Silva et al.，2009），可用于檢測(cè)真菌在寄主中的生長(zhǎng)速率、研究真菌與寄主侵染互作模式等（Cormack，1998）。目前多主棒孢對(duì)黃瓜的致病機(jī)理研究還不深入，利用多主棒孢RFP標(biāo)記轉(zhuǎn)化株有利于直接觀察病菌侵染過(guò)程，在抗病基因挖掘、致病機(jī)理分析等方面具有重要的意義。

農(nóng)桿菌基因介導(dǎo)技術(shù)（ATMT）一直用于植物基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)（Tinland，1996），直到1995年，Bundock等（1995）報(bào)道ATMT技術(shù)不僅能將農(nóng)桿菌的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物基因組中，也可轉(zhuǎn)移到釀酒酵母基因組中，自此，ATMT技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于真菌研究（Michielse et al.，2005）。與其他遺傳轉(zhuǎn)化方法相比，該技術(shù)最方便的優(yōu)勢(shì)是能以孢子、菌絲或子實(shí)體等為介導(dǎo)材料，操作方便且成功轉(zhuǎn)化率高（Minz & Sharon，2010）?；诖?，本試驗(yàn)擬利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法構(gòu)建黃瓜棒孢葉斑病病原菌RFP標(biāo)記轉(zhuǎn)化體系，獲得多主棒孢RFP標(biāo)記菌株，為多主棒孢侵染黃瓜的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年1～9月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

黃瓜棒孢葉斑病病原菌多主棒孢〔Corynspora cassiicola（Berk & Curt）Wei.〕 HG09031510（ 單 孢菌株），質(zhì)粒農(nóng)桿菌AGL-GNEN（攜帶RFP基因和潮霉素B抗性基因的質(zhì)粒pch-RFP），均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。

乙酰丁香酮水劑，98% MES，葡萄糖，甘油，HCl，KH2PO4，K2HPO4，NH4NO3，CaCl2，MgSO4·7H2O，NaCl，頭孢噻唑鈉，潮霉素B，卡那霉素，利福平，均購(gòu)自于北京酷來(lái)搏科技有限公司。

真菌基因組DNA提取試劑盒，ddH2O，DNA聚合酶，dNTP，MgCl2，16S rDNA 通用引物，瓊脂糖，TAE緩沖液，Goldview核酸染料，Loading Buffer，DNA marker DL5000，均購(gòu)自于天根生化科技（北京）有限公司。

PDA培養(yǎng)基（每升）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g；PD培養(yǎng)基不加瓊脂。

LB培養(yǎng)基（每升）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g；固體LB培養(yǎng)基另加瓊脂18 g。最后用蒸餾水定容至1 000 mL，并用NaOH將pH調(diào)至7.2。

YEB培養(yǎng)基（每升）：酵母提取物1 g，牛肉提取物5 g，蛋白胨 5 g，蔗糖 5 g，MgSO4·7H2O 4 g。

MM培養(yǎng)基（每升）：葡萄糖2 g，K2HPO42.05 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，CaCl20.01 g，NH4NO30.5 g，KH2PO41.45 g，NaCl 0.3 g，pH 調(diào)至 6.7～7.0。

IM培養(yǎng)基（每升）：MM培養(yǎng)基，甘油5 g，98% MES 8.7 g，乙酰丁香酮水劑 200 μmol·L-1，pH調(diào)至5.4（98% MES和乙酰丁香酮水劑均于滅菌完成后再加入）。

1.2 供試菌株對(duì)抗生素的敏感性測(cè)定

配制含不同濃度潮霉素B（0、10、20、50、80、100 μg·mL-1）的PDA平板，挑取活化后的黃瓜棒孢葉斑病菌菌餅（直徑5 mm）接種至平板中央，26 ℃黑暗培養(yǎng)5 d。觀察菌落生長(zhǎng)狀況，測(cè)量菌落直徑。配制含不同濃度（0、10、20、50、80、100 μg·mL-1）頭孢噻唑鈉和卡那霉素混合使用的LB平板，取100 μL農(nóng)桿菌菌液（OD600=0.3）均勻涂布于平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d，觀察菌落生長(zhǎng)狀況。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3 真菌轉(zhuǎn)化與篩選

ATMT轉(zhuǎn)化體系在Bundock等（1995）報(bào)道的方法上進(jìn)行優(yōu)化。挑取活化的農(nóng)桿菌AGL-GENE（含質(zhì)粒pch-RFP）單菌落接種于含50 μg·mL-1卡那霉素的MM培養(yǎng)基，28 ℃、22 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)物4 000 r·min-1離心1 min，用IM培養(yǎng)基稀釋，重復(fù)1次，用IM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h。將誘導(dǎo)培養(yǎng)的農(nóng)桿菌（100 μL）與制備好的黃瓜棒孢葉斑病菌孢子懸浮液（100 μL）混勻后，涂布于放置在YEB固體培養(yǎng)基的硝酸纖維素膜上。共培養(yǎng)后，將硝酸纖維素膜剪成條狀，反鋪在含潮霉素B、頭孢噻唑鈉和卡那霉素的PDA平板（選擇性培養(yǎng)基）上。26 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，挑選轉(zhuǎn)化株至選擇性培養(yǎng)基上，進(jìn)行再次篩選并保存。

1.4 RFP標(biāo)記菌株的PCR檢測(cè)

利用RFP特異性引物對(duì)轉(zhuǎn)化株基因組進(jìn)行PCR檢測(cè)。將轉(zhuǎn)化株接種至PD培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，收集菌絲，并進(jìn)行凍干處理。按照真菌基因組提取試劑盒的方法進(jìn)行DNA的提取。參考阮玲云等（2015）的方法，利用RFP特異性引物：RFP-F 5′-CGGGATCCATGGTGCGCT CCTCCAAGAA-3′，RFP-R 5′-GGACTAGTCTACAG GAACAGGTGGTGGC-3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物送北京博邁德基因技術(shù)有限公司測(cè)序。將所得的 DNA序列輸入GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行Blast檢索，采用DNAMAN軟件對(duì)所得到的核苷酸序列與GenBank中收錄的其他相應(yīng)基因的核苷酸序列進(jìn)行分析和比對(duì)，確定該轉(zhuǎn)化株是否含有RFP基因。

1.5 RFP標(biāo)記菌株的熒光穩(wěn)定性檢測(cè)

選擇紅色熒光強(qiáng)的菌落，單孢純化后在不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)6次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)2 、5 、10 d后通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行熒光觀察。

1.6 RFP標(biāo)記菌株的產(chǎn)孢量和致病性檢測(cè)

致病性檢測(cè)于2015年9月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗(yàn)溫室進(jìn)行。用直徑5 mm的無(wú)菌打孔器打取活化的轉(zhuǎn)化株菌餅，移接于PDA平板上，26 ℃培養(yǎng)15 d，使用血球計(jì)數(shù)板觀測(cè)轉(zhuǎn)化株的產(chǎn)孢量。對(duì)培養(yǎng)20 d的2片真葉期的中農(nóng)6號(hào)黃瓜幼苗分別接種轉(zhuǎn)化株和野生型菌株（陽(yáng)性對(duì)照），采用孢子懸浮液噴霧接種法，懸浮液孢子濃度為1×105個(gè)·mL-1，每個(gè)處理30株幼苗，3次重復(fù)。以清水接種為空白對(duì)照。接種后置于保濕柜中（28℃，相對(duì)濕度不低于90%），48 h后取出，放于28℃、相對(duì)濕度60%的溫室條件下正常管理，7 d后調(diào)查病情指數(shù)，并采用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株對(duì)抗生素的敏感性測(cè)定

黃瓜棒孢葉斑病菌野生型菌株HG09031510在含潮霉素B 50 μg·mL-1的PDA平板上生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)5 d后菌落直徑為2.3 cm；在含有80 μg·mL-1的潮霉素B平板上，只有極少量稀疏的菌絲生長(zhǎng)；在含100 μg·mL-1潮霉素B平板上，病菌不能生長(zhǎng)（圖1）。因此，轉(zhuǎn)化株篩選的潮霉素B濃度為100 μg·mL-1。在農(nóng)桿菌對(duì)頭孢噻唑鈉和卡那霉素混合使用的敏感性測(cè)定中，80、100 μg·mL-1的頭孢噻唑鈉和卡那霉素混合使用，平板培養(yǎng)2 d后，無(wú)菌落出現(xiàn)，選取低濃度80 μg·mL-1進(jìn)行篩選。因此，轉(zhuǎn)化株篩選的頭孢噻唑鈉和卡那霉素的濃度分別為80 μg·mL-1。

圖1 黃瓜棒孢葉斑病菌在含不同濃度潮霉素B的PDA上的生長(zhǎng)狀況

2.2 RFP標(biāo)記菌株的PCR鑒定

以轉(zhuǎn)化株HGRFP1510基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以野生型菌株HG09031510作為陰性對(duì)照，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化株得到685 bp的預(yù)期片段，而在野生型菌株中未擴(kuò)增出此條帶（圖2）。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，與DQ903896.1和DQ903889.1的同源性達(dá)到99%，進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)化成功，RFP基因已經(jīng)整合到了多主棒孢基因組中。

2.3 RFP標(biāo)記菌株的紅色熒光穩(wěn)定性檢測(cè)

圖2 RFP標(biāo)記菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果

連續(xù)6次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，使用熒光顯微鏡觀察RFP標(biāo)記菌株，培養(yǎng)后2、5、10 d均可在其菌絲和分生孢子上觀察到強(qiáng)烈的紅色熒光（圖3），而在野生型菌株中沒(méi)有觀察到熒光現(xiàn)象，表明紅色熒光蛋白基因能在RFP標(biāo)記菌株中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。

2.4 RFP標(biāo)記菌株的產(chǎn)孢量和致病性測(cè)定

2.4.1 RFP標(biāo)記菌株生長(zhǎng)速率及產(chǎn)孢量測(cè)定 多主棒孢RFP標(biāo)記菌株HGRFP1510與野生型菌株HG09031510在PDA上培養(yǎng)7 d后，菌落直徑分別為4.6 cm和4.8 cm（表1），RFP標(biāo)記菌株生長(zhǎng)速率略慢（圖4）。培養(yǎng)15 d后，對(duì)其孢子形態(tài)進(jìn)行觀察，RFP標(biāo)記菌株與野生型無(wú)差別；對(duì)其產(chǎn)孢量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)RFP標(biāo)記菌株正常產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量與野生型菌株差異不顯著（表1）。

2.4.2 RFP標(biāo)記菌株致病性測(cè)定 以多主棒孢野生型菌株HG09031510為陽(yáng)性對(duì)照、以清水接種為空白對(duì)照，進(jìn)行RFP標(biāo)記菌株的致病性試驗(yàn)，野生型菌株HG09031510與RFP標(biāo)記菌株均具有較強(qiáng)的致病力，病情指數(shù)分別為52.50和57.63，兩者間差異不顯著，均能引起典型的黃瓜棒孢葉斑病癥狀（圖5），說(shuō)明成功獲得RFP標(biāo)記菌株。

圖3 多主棒孢野生型菌株和RFP標(biāo)記菌株在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果

圖4 多主棒孢野生型菌株（A）與RFP標(biāo)記菌株（B）的菌落形態(tài)比較

表1 多主棒孢RFP標(biāo)記菌株與野生型菌株生物學(xué)特性比較

圖5 多主棒孢野生型菌株（A）與RFP標(biāo)記菌株（B）侵染黃瓜葉片癥狀

3 結(jié)論與討論

綠色熒光蛋白作為一種新型的標(biāo)記基因和報(bào)告基因廣泛應(yīng)用于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，作為標(biāo)記基因可用來(lái)觀察真菌定殖及其與寄主的互作機(jī)制（de Silva et al.，2009）。植物真菌熒光蛋白轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建方法主要有3種：農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法。PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法所需的原生質(zhì)體制備時(shí)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，過(guò)程復(fù)雜；而電擊轉(zhuǎn)化法對(duì)各種條件要求苛刻，轉(zhuǎn)化效率不高；農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法具有操作方便、轉(zhuǎn)化效率高、單拷貝比例高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行多主棒孢RFP轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建。含質(zhì)粒pch-RFP的農(nóng)桿菌AGL-GENE與多主棒孢孢子進(jìn)行共培養(yǎng)，在含有潮霉素B的篩選培養(yǎng)基上篩選得到轉(zhuǎn)化株，PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化株基因組，證明了紅色熒光蛋白基因確實(shí)轉(zhuǎn)入多主棒孢中。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了黃瓜棒孢葉斑病菌RFP標(biāo)記轉(zhuǎn)化體系，確定了轉(zhuǎn)化體系中潮霉素B的濃度為100 μg·mL-1，頭孢噻唑鈉和卡那霉素使用濃度分別為80 μg·mL-1，可為多主棒孢或其他產(chǎn)孢真菌其他目的基因的轉(zhuǎn)入提供參考。

真菌熒光蛋白轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建多用于侵染機(jī)制或寄主抗性反應(yīng)的研究中。曾有報(bào)道利用多主棒孢GFP轉(zhuǎn)化株研究多主棒孢對(duì)橡膠樹(shù)的侵染機(jī)制（Liu et al.，2014），本試驗(yàn)構(gòu)建的多主棒孢RFP標(biāo)記轉(zhuǎn)化株，為病原菌與植物互作的分子機(jī)理研究提供了新的思路。此外，本試驗(yàn)獲得的轉(zhuǎn)化株為研究黃瓜棒孢葉斑病菌形態(tài)發(fā)育、致病相關(guān)基因的克隆及病原物致病因子與寄主植物因子互作關(guān)系與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究奠定了基礎(chǔ)。

高葦，李寶聚，王萬(wàn)立，郝永娟，劉春艷，王勇．2012．基于ISSR 標(biāo)記的我國(guó)黃瓜多主棒孢菌群體遺傳結(jié)構(gòu)研究．中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2012年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集．

韓小爽，高葦，傅俊范，李寶聚．2011．李寶聚博士診病手記（三十五）黃瓜棒孢葉斑病的診斷與防治．中國(guó)蔬菜，（9）：20-21．

李寶聚，趙彥杰，于淑晶，柴阿麗，高葦．2008．李寶聚博士診病手記（六）2008年秋季河北青縣黃瓜棒孢葉斑病大發(fā)生．中國(guó)蔬菜，（11）：51-52．

李寶聚，高葦，石延霞，謝學(xué)文．2012．多主棒孢和棒孢葉斑病的研究進(jìn)展．植物保護(hù)學(xué)報(bào)，39（2）：171-176．

阮玲云，翁彩紅，陳世友，陳文星，賴春芬，艾柳英，胡開(kāi)輝，孫淑靜．2015．紅色熒光蛋白基因銀耳表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)鑒定．熱帶作物學(xué)報(bào)，36（10）：1814-1819．

楊雙娟，顧興芳，張圣平，苗晗，李寶聚．2012．黃瓜棒孢葉斑?。–orynespora cassiicola）的研究概況．中國(guó)蔬菜，（4）：1-9．

Bundock P，Dulk-Ras A，Beijeisbkrgen A，Hooykaas P J．1995．Trans-kingdom T-DNA transfer fromAgrobacterium tumefacienstoSaccharomyces cerevisiae．The EMBO Journal，14：3206-3214．

Cormack B．1998．Green fluorescent protein as a reporter of transcription and protein localization in fungi．Current Opinion in Microbiology，1（4）：406-410．

de Silva A P，Bolton M D，Nelson B D．2009．Transformation ofSclerotinia sclerotioumwith the green fluorescent protein gene and fluorescence of hyphae in four inoculated hosts．Plant Pathology，58：487-496．

D é on M，F(xiàn)umanal B，Gimenez S，Bieysse D，Oliveira R R，Shuib S S，Breton F，Elumalai S，Vida J B，Seguin M，Leroy T，Roeckel-Drevet P，Pujade-Renaud V．2014．Diversity of the cassiicolin gene inCorynespora cassiicolaand relation with the pathogenicity inHevea brasiliensis．Fungual Biology，118（1）：32-47．

Dixon L J，Schlub R L，Pernezny K，Datnoff L E．2009．Host specialization and phylogenetic diversity ofCorynespora cassiicola．Phytopathology，99：1015-1027．

Liu X M，Qi Y X，Zhang X，Xie Y X，Zhang H，Wei Y X，Pu J J．2014．Infection process ofCorynespora cassiicolatagged with GFP onHevea brasiliensis．Australasian Plant Pathology，43（5）：523-525．

Lorang J M，Tuori R P，Martinez J P，Sawyer T L，Redman R S，Rollins J A，Ciuffetti L M．2001．Green fluorescent protein is lighting up fungal biology．Appl Environ Microbiol，67：1987-1994．

Michielse C B，Hooykaas P J，VandenHondel C A，Ram A J．2005．Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi．Current Genetics，48（1）：1-17．

Minz A，Sharon A．2010．Electroporation and Agrobacterium-mediated spore transformation．Methods Mol Biol，638：21-32．

Miyamoto T，Ishii H，Stammlerc G，Koch A，Ogawara T，Tomita Y，Kobori S．2010．Distribution and molecular characterization ofCorynespora cassiicolaisolates resistant to Boscalid．Plant Pathology，59（5）：873-881．

Tinland B．1996．The integration of T-DNA into plant genomes．Trends in Plant Science，1（6）：178-184．