謝學文 張自心 武 軍 石延霞 柴阿麗 李寶聚

（中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京100081）

黃瓜（Cucumis sativusL.）是我國重要的蔬菜作物之一，種植面積居世界首位，且逐年增加。近幾年，由多主棒孢（Corynespora cassiicola）侵染引起的黃瓜棒孢葉斑病成為危害我國黃瓜生產(chǎn)的重要新流行病害（李寶聚 等，2008；韓小爽 等，2011；楊雙娟 等，2012），危害范圍和程度甚至超過霜霉病和白粉病。該菌寄主范圍廣泛，能夠侵染逾530種植物。國內(nèi)外有關(guān)該病菌的研究主要集中在生物學特性、遺傳穩(wěn)定性和抗藥性等方面（Dixon et al.，2009；Miyamoto et al.，2010；高葦 等，2012；李寶聚 等，2012；D é on et al.，2014），對多主棒孢致病機理及侵染途徑方面研究較少。

紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）最早從印度洋-太平洋地區(qū)的珊瑚蟲中分離而得，在不同溫度和pH條件下具有較高的穩(wěn)定性，且與其他蛋白形成的融合蛋白通常仍具有熒光，因其具有易于檢測、熒光穩(wěn)定、無毒害、種屬通用、易于構(gòu)建載體、可進行活細胞定位定時觀察等特性而得到廣泛關(guān)注（Lorang et al.，2001）。RFP隨機插入真菌基因組中，可直觀、快速、簡便地動態(tài)觀察真菌定殖及其與寄主的互作機制（de Silva et al.，2009），可用于檢測真菌在寄主中的生長速率、研究真菌與寄主侵染互作模式等（Cormack，1998）。目前多主棒孢對黃瓜的致病機理研究還不深入，利用多主棒孢RFP標記轉(zhuǎn)化株有利于直接觀察病菌侵染過程，在抗病基因挖掘、致病機理分析等方面具有重要的意義。

農(nóng)桿菌基因介導技術(shù)（ATMT）一直用于植物基因的轉(zhuǎn)導（Tinland，1996），直到1995年，Bundock等（1995）報道ATMT技術(shù)不僅能將農(nóng)桿菌的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物基因組中，也可轉(zhuǎn)移到釀酒酵母基因組中，自此，ATMT技術(shù)開始應(yīng)用于真菌研究（Michielse et al.，2005）。與其他遺傳轉(zhuǎn)化方法相比，該技術(shù)最方便的優(yōu)勢是能以孢子、菌絲或子實體等為介導材料，操作方便且成功轉(zhuǎn)化率高（Minz & Sharon，2010）?；诖?，本試驗擬利用農(nóng)桿菌介導法構(gòu)建黃瓜棒孢葉斑病病原菌RFP標記轉(zhuǎn)化體系，獲得多主棒孢RFP標記菌株，為多主棒孢侵染黃瓜的機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2015年1～9月在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所進行。

1.1 試驗材料

黃瓜棒孢葉斑病病原菌多主棒孢〔Corynspora cassiicola（Berk & Curt）Wei.〕 HG09031510（ 單 孢菌株），質(zhì)粒農(nóng)桿菌AGL-GNEN（攜帶RFP基因和潮霉素B抗性基因的質(zhì)粒pch-RFP），均由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供。

乙酰丁香酮水劑，98% MES，葡萄糖，甘油，HCl，KH2PO4，K2HPO4，NH4NO3，CaCl2，MgSO4·7H2O，NaCl，頭孢噻唑鈉，潮霉素B，卡那霉素，利福平，均購自于北京酷來搏科技有限公司。

真菌基因組DNA提取試劑盒，ddH2O，DNA聚合酶，dNTP，MgCl2，16S rDNA 通用引物，瓊脂糖，TAE緩沖液，Goldview核酸染料，Loading Buffer，DNA marker DL5000，均購自于天根生化科技（北京）有限公司。

PDA培養(yǎng)基（每升）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g；PD培養(yǎng)基不加瓊脂。

LB培養(yǎng)基（每升）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g；固體LB培養(yǎng)基另加瓊脂18 g。最后用蒸餾水定容至1 000 mL，并用NaOH將pH調(diào)至7.2。

YEB培養(yǎng)基（每升）：酵母提取物1 g，牛肉提取物5 g，蛋白胨 5 g，蔗糖 5 g，MgSO4·7H2O 4 g。

MM培養(yǎng)基（每升）：葡萄糖2 g，K2HPO42.05 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，CaCl20.01 g，NH4NO30.5 g，KH2PO41.45 g，NaCl 0.3 g，pH 調(diào)至 6.7～7.0。

IM培養(yǎng)基（每升）：MM培養(yǎng)基，甘油5 g，98% MES 8.7 g，乙酰丁香酮水劑 200 μmol·L-1，pH調(diào)至5.4（98% MES和乙酰丁香酮水劑均于滅菌完成后再加入）。

1.2 供試菌株對抗生素的敏感性測定

配制含不同濃度潮霉素B（0、10、20、50、80、100 μg·mL-1）的PDA平板，挑取活化后的黃瓜棒孢葉斑病菌菌餅（直徑5 mm）接種至平板中央，26 ℃黑暗培養(yǎng)5 d。觀察菌落生長狀況，測量菌落直徑。配制含不同濃度（0、10、20、50、80、100 μg·mL-1）頭孢噻唑鈉和卡那霉素混合使用的LB平板，取100 μL農(nóng)桿菌菌液（OD600=0.3）均勻涂布于平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d，觀察菌落生長狀況。每個處理3次重復。

1.3 真菌轉(zhuǎn)化與篩選

ATMT轉(zhuǎn)化體系在Bundock等（1995）報道的方法上進行優(yōu)化。挑取活化的農(nóng)桿菌AGL-GENE（含質(zhì)粒pch-RFP）單菌落接種于含50 μg·mL-1卡那霉素的MM培養(yǎng)基，28 ℃、22 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)物4 000 r·min-1離心1 min，用IM培養(yǎng)基稀釋，重復1次，用IM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h。將誘導培養(yǎng)的農(nóng)桿菌（100 μL）與制備好的黃瓜棒孢葉斑病菌孢子懸浮液（100 μL）混勻后，涂布于放置在YEB固體培養(yǎng)基的硝酸纖維素膜上。共培養(yǎng)后，將硝酸纖維素膜剪成條狀，反鋪在含潮霉素B、頭孢噻唑鈉和卡那霉素的PDA平板（選擇性培養(yǎng)基）上。26 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，挑選轉(zhuǎn)化株至選擇性培養(yǎng)基上，進行再次篩選并保存。

1.4 RFP標記菌株的PCR檢測

利用RFP特異性引物對轉(zhuǎn)化株基因組進行PCR檢測。將轉(zhuǎn)化株接種至PD培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，收集菌絲，并進行凍干處理。按照真菌基因組提取試劑盒的方法進行DNA的提取。參考阮玲云等（2015）的方法，利用RFP特異性引物：RFP-F 5′-CGGGATCCATGGTGCGCT CCTCCAAGAA-3′，RFP-R 5′-GGACTAGTCTACAG GAACAGGTGGTGGC-3′，進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物送北京博邁德基因技術(shù)有限公司測序。將所得的 DNA序列輸入GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行Blast檢索，采用DNAMAN軟件對所得到的核苷酸序列與GenBank中收錄的其他相應(yīng)基因的核苷酸序列進行分析和比對，確定該轉(zhuǎn)化株是否含有RFP基因。

1.5 RFP標記菌株的熒光穩(wěn)定性檢測

選擇紅色熒光強的菌落，單孢純化后在不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)6次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)2 、5 、10 d后通過熒光顯微鏡進行熒光觀察。

1.6 RFP標記菌株的產(chǎn)孢量和致病性檢測

致病性檢測于2015年9月在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所試驗溫室進行。用直徑5 mm的無菌打孔器打取活化的轉(zhuǎn)化株菌餅，移接于PDA平板上，26 ℃培養(yǎng)15 d，使用血球計數(shù)板觀測轉(zhuǎn)化株的產(chǎn)孢量。對培養(yǎng)20 d的2片真葉期的中農(nóng)6號黃瓜幼苗分別接種轉(zhuǎn)化株和野生型菌株（陽性對照），采用孢子懸浮液噴霧接種法，懸浮液孢子濃度為1×105個·mL-1，每個處理30株幼苗，3次重復。以清水接種為空白對照。接種后置于保濕柜中（28℃，相對濕度不低于90%），48 h后取出，放于28℃、相對濕度60%的溫室條件下正常管理，7 d后調(diào)查病情指數(shù)，并采用SAS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株對抗生素的敏感性測定

黃瓜棒孢葉斑病菌野生型菌株HG09031510在含潮霉素B 50 μg·mL-1的PDA平板上生長緩慢，培養(yǎng)5 d后菌落直徑為2.3 cm；在含有80 μg·mL-1的潮霉素B平板上，只有極少量稀疏的菌絲生長；在含100 μg·mL-1潮霉素B平板上，病菌不能生長（圖1）。因此，轉(zhuǎn)化株篩選的潮霉素B濃度為100 μg·mL-1。在農(nóng)桿菌對頭孢噻唑鈉和卡那霉素混合使用的敏感性測定中，80、100 μg·mL-1的頭孢噻唑鈉和卡那霉素混合使用，平板培養(yǎng)2 d后，無菌落出現(xiàn)，選取低濃度80 μg·mL-1進行篩選。因此，轉(zhuǎn)化株篩選的頭孢噻唑鈉和卡那霉素的濃度分別為80 μg·mL-1。

圖1 黃瓜棒孢葉斑病菌在含不同濃度潮霉素B的PDA上的生長狀況

2.2 RFP標記菌株的PCR鑒定

以轉(zhuǎn)化株HGRFP1510基因組DNA為模板進行PCR擴增，以野生型菌株HG09031510作為陰性對照，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化株得到685 bp的預期片段，而在野生型菌株中未擴增出此條帶（圖2）。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)NCBI進行Blast比對，與DQ903896.1和DQ903889.1的同源性達到99%，進一步證實轉(zhuǎn)化成功，RFP基因已經(jīng)整合到了多主棒孢基因組中。

2.3 RFP標記菌株的紅色熒光穩(wěn)定性檢測

圖2 RFP標記菌株P(guān)CR擴增結(jié)果

連續(xù)6次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，使用熒光顯微鏡觀察RFP標記菌株，培養(yǎng)后2、5、10 d均可在其菌絲和分生孢子上觀察到強烈的紅色熒光（圖3），而在野生型菌株中沒有觀察到熒光現(xiàn)象，表明紅色熒光蛋白基因能在RFP標記菌株中穩(wěn)定遺傳和表達。

2.4 RFP標記菌株的產(chǎn)孢量和致病性測定

2.4.1 RFP標記菌株生長速率及產(chǎn)孢量測定 多主棒孢RFP標記菌株HGRFP1510與野生型菌株HG09031510在PDA上培養(yǎng)7 d后，菌落直徑分別為4.6 cm和4.8 cm（表1），RFP標記菌株生長速率略慢（圖4）。培養(yǎng)15 d后，對其孢子形態(tài)進行觀察，RFP標記菌株與野生型無差別；對其產(chǎn)孢量進行測定，發(fā)現(xiàn)RFP標記菌株正常產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量與野生型菌株差異不顯著（表1）。

2.4.2 RFP標記菌株致病性測定 以多主棒孢野生型菌株HG09031510為陽性對照、以清水接種為空白對照，進行RFP標記菌株的致病性試驗，野生型菌株HG09031510與RFP標記菌株均具有較強的致病力，病情指數(shù)分別為52.50和57.63，兩者間差異不顯著，均能引起典型的黃瓜棒孢葉斑病癥狀（圖5），說明成功獲得RFP標記菌株。

圖3 多主棒孢野生型菌株和RFP標記菌株在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果

圖4 多主棒孢野生型菌株（A）與RFP標記菌株（B）的菌落形態(tài)比較

表1 多主棒孢RFP標記菌株與野生型菌株生物學特性比較

圖5 多主棒孢野生型菌株（A）與RFP標記菌株（B）侵染黃瓜葉片癥狀

3 結(jié)論與討論

綠色熒光蛋白作為一種新型的標記基因和報告基因廣泛應(yīng)用于原核細胞和真核細胞，作為標記基因可用來觀察真菌定殖及其與寄主的互作機制（de Silva et al.，2009）。植物真菌熒光蛋白轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建方法主要有3種：農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法、PEG介導原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法。PEG介導轉(zhuǎn)化法所需的原生質(zhì)體制備時費時費力，過程復雜；而電擊轉(zhuǎn)化法對各種條件要求苛刻，轉(zhuǎn)化效率不高；農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法具有操作方便、轉(zhuǎn)化效率高、單拷貝比例高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定等特點而被廣泛應(yīng)用。本試驗利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法進行多主棒孢RFP轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建。含質(zhì)粒pch-RFP的農(nóng)桿菌AGL-GENE與多主棒孢孢子進行共培養(yǎng)，在含有潮霉素B的篩選培養(yǎng)基上篩選得到轉(zhuǎn)化株，PCR擴增轉(zhuǎn)化株基因組，證明了紅色熒光蛋白基因確實轉(zhuǎn)入多主棒孢中。本試驗成功構(gòu)建了黃瓜棒孢葉斑病菌RFP標記轉(zhuǎn)化體系，確定了轉(zhuǎn)化體系中潮霉素B的濃度為100 μg·mL-1，頭孢噻唑鈉和卡那霉素使用濃度分別為80 μg·mL-1，可為多主棒孢或其他產(chǎn)孢真菌其他目的基因的轉(zhuǎn)入提供參考。

真菌熒光蛋白轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建多用于侵染機制或寄主抗性反應(yīng)的研究中。曾有報道利用多主棒孢GFP轉(zhuǎn)化株研究多主棒孢對橡膠樹的侵染機制（Liu et al.，2014），本試驗構(gòu)建的多主棒孢RFP標記轉(zhuǎn)化株，為病原菌與植物互作的分子機理研究提供了新的思路。此外，本試驗獲得的轉(zhuǎn)化株為研究黃瓜棒孢葉斑病菌形態(tài)發(fā)育、致病相關(guān)基因的克隆及病原物致病因子與寄主植物因子互作關(guān)系與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究奠定了基礎(chǔ)。

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