王慧媛+張紫荊+袁封艷

[摘要] 目的 探討同型半胱氨酸（Hcy）對人主動脈平滑肌細胞ATP結合盒轉運蛋白A1（ABCA1）啟動子甲基化水平及表達的影響。 方法 培養(yǎng)人主動脈平滑肌細胞，將其分為兩組：對照組和實驗組。對照組不加Hcy，實驗組加入不同濃度Hcy（50、100、200、500 μmol/L）培養(yǎng)48 h。閃爍計數(shù)法檢測膽固醇流出率；實時定量PCR檢測ABCA1 mRNA表達水平；Western-blotting檢測ABCA1蛋白質表達；巢式甲基化PCR檢測ABCA1啟動子甲基化水平。 結果 對照組各時間點膽固醇流出率比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；各Hcy濃度組不同時間比較顯示，24、48 h膽固醇流出率均明顯低于0、12 h，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與對照組比較，0、12 h各Hcy濃度組膽固醇流出率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），24、48 h各Hcy濃度組膽固醇流出率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與對照組比較，實驗組ABCA1 mRNA相對表達水平下降（均P < 0.05），ABCA1蛋白質相對表達水平下降（P < 0.05），ABCA1啟動子甲基化水平顯著升高（P < 0.05）；不同Hcy濃度之間比較，ABCA1mRNA表達、ABCA1蛋白質表達和ABCA1啟動子甲基化水平差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結論 Hcy使人主動脈平滑肌細胞ABCA1啟動子甲基化水平升高及表達下降，引起膽固醇流出率降低，可能是其引起動脈粥樣硬化的病理機制之一。

[關鍵詞] 同型半胱氨酸；ATP結合盒轉運蛋白A1；甲基化；血管平滑肌細胞

[中圖分類號] R543.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（b）-0019-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of homocysteine （Hcy） on the promoter methylation and expression of ATP binding cassette transporter A1 （ABCA1） in human aortic smooth muscle cells. Methods The human aortic smooth muscle cells were divided into two groups： the control group and the experimental group. The cells in the control group were cultured without Hcy， however cells in the experimental group were cultured with different concentrations of Hcy （50， 100， 200， 500 μmol/L）. The cholesterol outflow rate was detected by scintillation counting technique， the expression of ABCA1 mRNA was detected by real-time quantitative PCR， the expression of ABCA1 protein was detected by Western-blotting， the ABCA1 promoter methylation was detected by nested detection of PCR. Results There was no significant difference in cholesterol efflux rate at each time point in the control group （P > 0.05）. Compared with Hcy treatment for 0 h and 12 h， after treatment of 24 h and 48 h the cholesterol efflux rate of the experimental were significantly decreased （P < 0.05）. After treated with Hcy for 0 h and 12 h， compared with the control group， there was no significant difference in cholesterol efflux rate （P > 0.05）. After treated with Hcy for 24 h and 48 h， compared with the control group， cholesterol efflux rate of the experimental group was significantly decreased （P < 0.05）. Compared with control group， ABCA1 mRNA relative expression level decreased （P < 0.05）， the relative expression level of ABCA1 protein was decreased （P < 0.05）， ABCA1 promoter methylation level was significantly increased （P < 0.05）. There was no significant difference in ABCA1mRNA expression， ABCA1 protein expression and ABCA1 promoter methylation level between different Hcy concentrations groups （P > 0.05）. Conclusion Hcy can increase the methylation level of ABCA1 promoter and decrease the expression of ABCA1 in aortic smooth muscle cells that lead to lower cholesterol efflux rate， which may be one of the pathological mechanisms of atherosclerosis.endprint

[Key words] Homocysteine； ATP binding cassette transporter A1； Methylation； Vascular smooth muscle cells

血管平滑肌細胞膽固醇流出減少轉化為泡沫細胞是動脈粥樣硬化病理改變之一[1]。ATP結合盒轉運蛋白A1（ATP-binding cassette transporterA1，ABCAl）是介導膽固醇流出的限速因子，其功能下降會引起膽固醇流出障礙[2]。人類ABCAl基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平增高能夠引起其表達及功能下降[3]。同型半胱氨酸（homocysteinemia，Hcy）是動脈粥樣硬化的獨立危險因素，其表觀遺傳機制越來越受到重視。Hcy增高會加速蛋氨酸循環(huán)，引起DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）增加，導致特定基因甲基化水平增高而影響其表達和功能[4]。已有研究表明，Hcy可以引起人單核源性泡沫細胞ABCA1基因甲基化水平上升[5]，導致膽固醇流出率下降，Hcy對人血管平滑肌細胞ABCA1基因啟動子甲基化水平是否存在影響，目前尚無相關報道，對此本文進行探討。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

液體閃爍計數(shù)儀（美國PerkinElmer）；T/G HAVSMC細胞株（上海弘順）；Hcy和[3H]膽固醇（美國Sigma）；ABCA1一抗（英國Abcam），β-actin一抗（北京中杉金橋），HRP二抗（1∶500，武漢博士德）；DNA甲基化修飾試劑盒（美國Epigenek）。

1.2 平滑肌細胞復蘇、培養(yǎng)與分組

人主動脈平滑肌細胞株（T/G HAVSMC）細胞來自美國ATCC公司，復蘇細胞株后培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：89%DMEM（高糖）+10%FBS+1%雙抗，細胞密度達到80%以上進行1∶2或1∶3傳代，2～3 d換液周期，取傳3～4代后細胞進行實驗，實驗分為，①對照組：加入0 μmol/L Hcy；②實驗組：加入不同濃度Hcy（50、100、200、500 μmol /L）培養(yǎng)，每組5瓶。

1.3 膽固醇流出實驗

將加入不同濃度 Hcy培養(yǎng)T/G HAVSMC細胞至0、12 、24 h及48 h時間點，用0.2μCi/mL[3H]膽固醇在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育48 h，待細胞長至85%時，用PBS液洗滌細胞2次，置含100 μg/mL的高密度脂蛋白的無血清DMEM培養(yǎng)基中孵育16 h，用閃爍計數(shù)法檢測培養(yǎng)液和細胞中的[3H]膽固醇，膽固醇流出率=培養(yǎng)液中[3H]/總[3H]（培養(yǎng)液[3H]+細胞[3H]）×100%[6]。見圖1。

1.4 ABCA1 mRNA表達水平檢測

收集細胞，抽提總RNA逆轉錄合成cDNA，采用實時定量PCR法檢測GAPDH、ABCA1 mRNA的含量，反應條件為：95℃預變性3 min后40次循環(huán)擴增（95℃ 10 s，58℃ 30 s，58℃ 30 s）。以GAPDH為內參，計算其相對表達量，數(shù)據采用2-ΔΔCt分析。引物序列如下：ABCA1：上游5′-GGGTGGTGTTCTTCCTCATTAC?TG-3′；下游5′-CCGCCTCACATCTTCATCTTCATC-3′；5′-AGCGTAGCGTTCTCATCC-3′；GAPDH上游5′-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′；下游5′-CGCT?CCTGGAAGATGGTGATGG-3′[7]。

1.5 ABCA1蛋白質表達水平檢測

使用Western-blotting方法，提取T/G HAVSMC細胞總蛋白，4℃離心后取上清，使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量后行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，加入 ABCA1一抗（1∶500）和β-actin（1∶1000）4℃孵育過夜，結合HRP二抗孵育1 h，加入ECL化學發(fā)光劑，暗室曝光、顯影和定影。膠片掃描結果采用 Quantity-one軟件分析，將目的條帶與β-actin光密度值比較，所得比值表示蛋白相對含量。

1.6 ABCA1啟動子甲基化水平檢測

參照本課題組建立的方法[8]，使用巢式甲基化PCR檢測，在線設計外引物（Out）、甲基化引物（M）和非甲基化引物（U）（見表1）。提取T/G HAVSMC細胞DNA，用重亞硫酸鹽處理后進行2次PCR，取擴增產物瓊脂糖凝膠電泳，采集圖像Quantity-One軟件分析，測量甲基化和非甲基化條帶光密度值，二者比值反映甲基化水平。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膽固醇流出實驗

對照組各時間點間膽固醇流出率比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；各Hcy濃度組不同時間比較顯示，24、48 h膽固醇流出率均明顯低于0、12 h，差異有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。與對照組比較，0、12 h各Hcy濃度組膽固醇流出率差異無統(tǒng)計學意義（均P > 0.05）；24、48 h各Hcy濃度組膽固醇流出率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。雙因素方差分析顯示，Hcy對膽固醇流出率的影響差異有統(tǒng)計學意義（F=9.551，P < 0.01），時間對膽固醇流出率的影響具有統(tǒng)計學意義（F=3.447，P < 0.05），Hcy和時間對膽固醇流出率的交互影響差異無統(tǒng)計學意義（F=0.8179， P > 0.05。見表2。

2.2 ABCA1 mRNA和蛋白質表達以及啟動子甲基化水平endprint

與對照組比較，不同濃度Hcy導致T/G HAVSMC細胞ABCA1 mRNA表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（表3）；與對照組比較，不同濃度Hcy導致T/G HAVSMC細胞ABCA1蛋白質表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖2、表3）；與對照組比較，不同濃度Hcy導致T/G HAVSMC細胞ABCA1啟動子甲基化水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖3、表3）。不同Hcy濃度之間比較，ABCA1 mRNA表達、ABCA1蛋白質表達和ABCA1啟動子甲基化水平差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

3 討論

巨噬細胞和血管平滑肌細胞內膽固醇流出減少引起膽固醇沉積，轉化成為泡沫細胞是動脈粥樣硬化的發(fā)病機制之一[9]。研究表明，Hcy能夠引起巨噬細胞膽固醇流出率下降[10-11]，然而Hcy能否導致血管平滑肌細胞膽固醇流出率改變，目前尚無相關報道。在本實驗中，用不同濃度的Hcy處理平滑肌細胞24 h和48 h后，膽固醇流出率下降，雙因素方差分析提示Hcy和時間對膽固醇流出率都具有影響，說明了Hcy能夠降低血管平滑肌細胞膽固醇流出率。動脈粥樣硬化病變部位的血管平滑肌細胞中ABCA1表達明顯下降[11]，研究表明，ABCA1啟動子甲基化水平增高可以導致其表達下降[2]。Hcy增高對于特定基因啟動子甲基化的存在不同的影響[12]。在本實驗中，在不同濃度Hcy的作用下，人主動脈平滑肌細胞ABCA1啟動子甲基化水平顯著升高，同時其mRNA和蛋白質表達均下降，可能的原因是Hcy增高會加速了蛋氨酸循環(huán)，引起DNMTs增加，DNMTs增高可以引起某些基因啟動子區(qū)的高甲基化，從而引起基因沉默及表達下降[13]。

本實驗研究結果還顯示，用Hcy處理24 h和48 h后，100 μmol/L Hcy組膽固醇流出率最低，但差異無統(tǒng)計學意義，即Hcy的作用不具有劑量依賴性的。高濃度的Hcy的作用并未相應增強，其可能的原因是Hcy通過多種機制對血管平滑肌細胞產生影響，當濃度進一步升高后，其促進氧化應激、細胞凋亡、炎性反應等機制可能對細胞造成更嚴重的傷害，從而掩蓋其對甲基化修飾的影響，與類似的研究結果相同[5，10]。

綜上所述，Hcy可以導致人主動脈平滑肌細胞ABCA1啟動子甲基化水平升高，引起其表達下降，造成膽固醇流出率的降低，可能是其引起AS的發(fā)病原因之一。目前針對巨噬細胞轉化的研究較多，而對于血管平滑肌細胞研究較少，而血管平滑肌細胞的轉化在AS的發(fā)病中具有重要的意義[12]，該研究深化了Hcy致動脈粥樣硬化機制的認識，為尋找新的作用靶點提供有意義的實驗依據。

[參考文獻]

[1] Vengrenyuk Y，Nishi H，Long X，et al. Cholesterol loading re-programs the miR-143/145-myocardin axis to convert aortic smooth muscle cells to a dysfunctional macrophage-like phenotype [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2015， 35（3）：535-546.

[2] Lv YC，Tang YY，Zhang P，et al. Histone Methyltransferase Enhancer of Zeste Homolog 2-Mediated ABCA1 Promoter DNA Methylation Contributes to the Progression of Athero?sclerosis [J]. PloS One，2016，11（6）：e0157265-e0157283.

[3] Guay S P，Légaré C，Houde A，et al. Acetylsalicylic acid，aging and coronary artery disease are associated with ABCA1 DNA methylation in men [J]. Clinical Epigenetics，2014，6（1）：14-21.

[4] 高勝利，李莉，翟曉娟，等.心血管疾病中同型半胱氨酸與高密度脂蛋白膽固醇的關系[J].中華高血壓雜志，2015 （6）：522-525.

[5] Liang Y，Yang X，Ma L，et al. Homocysteine-mediated cho?lesterol efflux via ABCA1 and ACAT1 DNA methylation in THP-1 monocyte-derived foam cells [J]. Acta Biochim Biophys Sin （Shanghai），2013，45（3）：220-228.

[6] Coisne C，Hallier-Vanuxeem D，Boucau M C，et al. β-Cyclodextrins Decrease Cholesterol Release and ABC-Associated Transporter Expression in Smooth Muscle Cells and Aortic Endothelial Cells [J]. Frontiers in Physiology，2016，25（7）：185-199.

[7] Su XM，Wei Y，Wang Y，et al. ABCA1 mRNA expression and cholesterol outflow in U937 cells [J]. Int J Clin Expe Pathol，2015，8（3）：3116-3121.

[8] 高勝利，李莉，翟曉娟，等.5-雜氮-2'-脫氧胞苷改善高同型半胱氨酸血癥大鼠內皮功能的機制[J].中華心血管病雜志，2016，44（8）：700-706.

[9] Afacan NJ，Chan T，Pistolic J，et al. Low Doses of Innate Defence Regulator Peptide，IDR-1018，Enhances HDL-Mediated Cholesterol Efflux from Smooth Muscle Cells and Macrophages [J]. J Nutr Biol，2016， 2（1）：75-89.

[10] 梅歆，乾威，馬麗娜·艾山拜，等.血脂尿酸同型半胱氨酸糖化血紅蛋白與腦小血管病嚴重程度的相關性[J].西部醫(yī)學，2016，28（6）：815-817，822.

[11] 隋淼，于揚，張弢，等.老年糖尿病合并亞臨床甲減患者顱內動脈粥樣硬化發(fā)生及影響因素分析[J].疑難病雜志，2017，16（9）：877-880.

[12] Jamaluddin MD，Chen I，Yang F，et al. Homocysteine inh?ibits endothelial cell growth via DNA hypomethylation of the cyclin A gene [J]. Blood，2007，110（10）：3648-3655.

[13] He M，F(xiàn)an J，Jiang R，et al. Expression of DNMTs and genomic DNA methylation in gastric signet ring cell car?cinoma [J]. Molecular Medicine Reports，2013，8（3）：942-948.

（收稿日期：2017-09-05 本文編輯：任 念）endprint