包鵬云，李璐瑤，陳煒，孫靜嫻，左然濤，馬悅欣

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023)

益生菌是活的、死的微生物細(xì)胞或其組分，一旦有飼料或養(yǎng)殖水供給時，可能通過增加宿主或其周圍環(huán)境的微生物平衡使其飼料優(yōu)化，達(dá)到提高宿主抗病力、耐受脅迫反應(yīng)和生長性能的目的，從而有益于宿主健康水平[1]。

近年來，益生菌在刺參Apostichopus japonicus養(yǎng)殖中的應(yīng)用已成為研究熱點，飼料中添加外源枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[2]和混合內(nèi)源益生菌(梅奇酵母Metschnikowia sp.C14+芽孢桿菌Bacillus sp.BC26)[3]可提高幼參腸道異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)。單一內(nèi)源細(xì)菌包括枯草芽孢桿菌[4]、馬氏副球菌Paracoccus marcusii DB11[5]、假交替單胞菌Pseudoalteromonas elyakovii HS1[6]和希瓦氏菌Shewanella japonica HS7[6]，海洋酵母包括梅奇酵母C14[7]、仙人掌有孢漢遜酵母Hanseniaspora opuntiae C21[8]、紅酵母Rhodotorula benthica D30[9]和紅酵母Rhodotorula sp.C11[10]等均可促進幼參生長。芽孢桿菌BC26[11]、梅奇酵母C14[7]、仙人掌有孢漢遜酵母C21[8]、紅酵母D30[9]和紅酵母C11[12]等能提高幼參腸道消化酶活力。將內(nèi)源混合菌 (乳酸菌L-2+芽孢桿菌K-3)加入養(yǎng)殖水體中，可提高幼參腸蛋白酶和淀粉酶等消化酶活力[13]。商品復(fù)合益生菌 (枯草芽孢桿菌+嗜酸乳桿菌Lactobacilli acidophilus+釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae)可促進幼參生長，但對其消化酶活力和體壁營養(yǎng)組成無顯著影響[14]?；旌蟽?nèi)源益生菌可提高幼參生長和消化酶活力[3]，而對其營養(yǎng)組成的影響尚未見報道。已有研究表明，由梅奇酵母C14[7]、紅酵母H26[15]和芽孢桿菌BC26[11]組成的內(nèi)源混合菌可促進幼參免疫反應(yīng)并影響其抗氧化性能[16]。為此，本研究中，分析了這3株益生菌的混合菌對幼參生長、消化酶活力和體壁營養(yǎng)組成的影響，旨在為益生菌在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用健康幼參購買于大連某刺參養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1.2.1 含菌飼料的制備及試驗設(shè)計 益生菌梅奇酵母C14和芽孢桿菌BC26從刺參腸道分離獲得，紅酵母H26從刺參呼吸樹分離獲得。

將梅奇酵母C14菌株和紅酵母H26菌株接種到酵母膏胨葡萄糖液體培養(yǎng)基，將芽孢桿菌BC26菌株接種到胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，于25℃下振蕩培養(yǎng)16 h，將菌懸液離心，生理鹽水重懸細(xì)胞，血球計數(shù)板計數(shù)。將菌液添加到幼參基礎(chǔ)飼料，配方同文獻(xiàn) [17]，制備含C14菌株 (1×105cells/g)+H26菌株 (1×105cells/g)+BC26菌株(1×107cells/g)的飼料，菌株劑量同文獻(xiàn) [16]，試驗飼料每天制備一次以保證菌株活力。

將幼參暫養(yǎng) 2周，選擇體質(zhì)量為 (0.54±0.06)g的幼參隨機分配到6個盛過濾海水的塑料桶中，每桶200頭，用含菌飼料和基礎(chǔ)飼料分別投喂3桶幼參，每日投喂1次，投喂量為體質(zhì)量的5%，每2 d換水1/2，吸底，用氣石充氣。試驗期間，溫度為16～24℃，pH為7.8～8.2，鹽度為30。1.2.2 樣品采集 幼參養(yǎng)殖第4周和第8周時，分別從每桶中隨機取10頭幼參，饑餓20 h使腸道內(nèi)容物排空。用無菌過濾海水沖洗幼參體表，斷尾解剖，將同一桶中幼參的腸道合并于離心管中，稱量其質(zhì)量，加入4倍體積的無菌生理鹽水，用勻漿器勻漿后取一部分用于腸道細(xì)菌和酵母菌計數(shù)，剩余部分用液氮迅速冷凍后超低溫 (-80℃)保存。

將保存于-80℃的腸道勻漿液在4℃下解凍，加入等量的生理鹽水，用于腸道消化酶活力的測定。取足量的幼參進行解剖，去除內(nèi)臟，保存體壁于冰箱 (-80℃)中，用于營養(yǎng)組成分析。

1.2.3 蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍(lán)法[18]測定腸道勻漿液上清液中總蛋白含量。

1.2.4 幼參腸道微生物計數(shù) 將腸道勻漿液梯度稀釋，取100 μL涂布于2216E瓊脂平板 (異養(yǎng)細(xì)菌)、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂平板(弧菌)和酵母膏胨葡萄糖瓊脂平板 (酵母菌)，25℃下培養(yǎng)7 d，進行計數(shù)。

1.2.5 生長指標(biāo)測定 分別在投喂前、第4周和第8周時對幼參體質(zhì)量進行測定。從每個桶中隨機取30頭幼參，用紗布吸去體表水分后稱量其體質(zhì)量。特定生長率 (%/d)計算公式為

特定生長率(SGR)＝(ln Wt-ln W0)/t×100%。其中：W0和Wt分別為初始體質(zhì)量和試驗t天時的體質(zhì)量 (g)；t為試驗時間 (d)。

1.2.6 消化酶活力測定 采用南京建成科技有限公司試劑盒測定幼參腸道胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力，利用Epoch酶標(biāo)儀進行測定，檢測方法參照說明書 (將反應(yīng)溫度37℃ 修改為室溫 20～24℃)。

1.2.7 體壁營養(yǎng)組成測定 分別采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2010)、分光光度計法 (GB/T 9695.31—2008)、索氏抽提法 (GB/T 5009.6—2003)、馬弗爐灼燒法 (GB/T 5009.4—2010)測定幼參體壁粗蛋白質(zhì)、糖分、粗脂肪和灰分含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±S.D.)表示，并采用SPSS 16.0軟件進行獨立樣本t檢驗，置信度為95%。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌在幼參腸道的存活及對幼參腸道微生物數(shù)量的影響

從表1可見：養(yǎng)殖第4周和第8周時，幼參腸道芽孢桿菌BC26數(shù)量達(dá)到37.57×106CFU/g(腸道)和30.10×106CFU/g(腸道)，成為腸道優(yōu)勢細(xì)菌，分別占總異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的76.94%和81.57%；酵母菌只有投喂的兩株，其中梅奇酵母C14數(shù)量為(1.78～2.79)×105CFU/g(腸道)， 紅酵母H26數(shù)量為(4.45～7.75)×103CFU/g(腸道)，梅奇酵母數(shù)量是紅酵母H26的37～40倍；益生菌組幼參腸道異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量顯著高于對照組 (P＜0.05)，但弧菌數(shù)量顯著低于對照組 (P＜0.05)。

2.2 益生菌對幼參生長的影響

從圖1可見，養(yǎng)殖第4周和8周時，益生菌組幼參特定生長率均顯著高于對照組 (P＜0.05)。

2.3 益生菌對幼參消化酶的影響

從表2可見，養(yǎng)殖第4周和第8周時，與對照組相比，益生菌可顯著提高幼參腸道胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活力 (P＜0.05)。

2.4 益生菌對幼參體壁營養(yǎng)組成的影響

從表3可見，養(yǎng)殖第4周和第8周時，益生菌組幼參體壁粗蛋白質(zhì)和糖分含量均顯著高于對照組(P＜0.05)；第8周時，益生菌組幼參體壁灰分含量顯著低于對照組 (P＜0.05)；第4周和第8周時，益生菌組和對照組幼參體壁粗脂肪含量，以及第4周時兩組幼參灰分含量均無顯著性差異 (P＞0.05)。

表1 幼參腸道益生菌、異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌數(shù)量Tab.1 Numbers of probotics，heterotrophic bacteria and vibrios in intestine of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus CFU/g intestine

表2 益生菌對幼參腸道消化酶活力的影響Tab.2 Effect of probiotics on the intestinal digestive enzyme activity of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

圖1 益生菌對幼參特定生長率的影響Fig.1 Effect of mixed probiotics on specific growth rate of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

表3 益生菌對幼參體壁營養(yǎng)組成的影響 (干質(zhì)量)Tab.3 Effect of probiotics on nutrient profile of body wall in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus(dry weight) w/%

3 討論

3.1 益生菌對幼參腸道異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌數(shù)量的影響

已有研究表明，給南非鮑 (殼長約50 mm)投喂含內(nèi)源混合菌 (弧菌Vibrio midae SY9+隱球酵母Cryptococcus sp.SS1+漢遜德巴利酵母Debaryomyces hansenii AY1，各約107cells/g飼料)飼料3周后，其腸道中可培養(yǎng)益生菌數(shù)量為106～107CFU/g(腸道)[19]。給幼參投喂添加外源枯草芽孢桿菌(107CFU/g飼料)飼料8周，可提高其腸道異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量[2]；投喂添加外源干酵母 (1%和 2%)飼料8周，能顯著降低幼參腸道內(nèi)弧菌數(shù)，并顯著提高其腸道中酵母菌數(shù)[20]；投喂添加內(nèi)源混合菌(105cells/g梅奇酵母C14+107cells/g芽孢桿菌BC26)飼料4周，可提高幼參腸道異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量和酵母菌 (投喂菌)數(shù)量[3]，其中投喂細(xì)菌占異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的90%，投喂酵母菌占可培養(yǎng)酵母菌總數(shù)的100%。與已有研究結(jié)果類似，本研究中給幼參投喂含混合益生菌飼料4周和8周后，3株益生菌成為幼參腸道優(yōu)勢菌，其數(shù)量為103～107CFU/g(腸道)，表明其在消化道中的存活能力很強，并能增加腸道可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量，降低弧菌數(shù)量。本研究表明，飼料中補充益生菌可顯著影響水生動物腸道中微生物數(shù)量。但3株菌是否能夠在腸道中定植，可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的增加是否與其在腸道中定植有關(guān)有待于進一步研究。

3.2 益生菌對幼參生長的影響

某些益生菌作為飼料添加劑應(yīng)用于幼參養(yǎng)殖中可促進其生長，如投喂添加0.8%商品復(fù)合益生菌制劑 (枯草芽孢桿菌+嗜酸乳桿菌+釀酒酵母，各種菌均大于106CFU/g)飼料8周[14]和投喂添加內(nèi)源混合菌 (梅奇酵母C14+芽孢桿菌BC26)飼料4周[3]，均能顯著提高幼參的特定生長率。與此類似，給南非鮑 (殼長分別為20、67 mm)投喂含混合菌 (弧菌SY9+隱球酵母SS1+漢遜德巴利酵母AY1，各約107cells/g)飼料8個月，其生長速率顯著提高[21-22]。本研究中，飼料中添加一定濃度的混合內(nèi)源益生菌4周、8周，顯著提高了幼參特定生長率，與Macey等[21]及李明[3]的研究結(jié)果類似，這是因為益生菌能促進消化酶活力進而提高消化率。益生菌營養(yǎng)豐富，可能是動物的營養(yǎng)強化劑。

3.3 益生菌對幼參消化酶的影響

飼料中添加適宜濃度的益生菌有利于水生動物的消化過程。投喂添加混合益生菌 (弧菌SY9+隱球酵母SS1+漢遜德巴利酵母AY1，各約107cells/g)飼料8個月，南非鮑消化道腸區(qū)蛋白酶活力顯著增加，這與鮑消化道腸區(qū)蛋白消化和吸收量的顯著增加相關(guān)[21]。用含混合益生菌 (梅奇酵母C14+芽孢桿菌BC26)的飼料投喂幼參4周后，其腸道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力均顯著提高[3]。本試驗中，投喂添加一定濃度的混合內(nèi)源益生菌飼料(4周和8周)，顯著提高了幼參腸道胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力，但幼參消化酶的提高是否與微生物合成的酶有關(guān)需要進一步研究，因為芽孢桿菌BC26[22]和紅酵母H26均可分泌胞外蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶 (未發(fā)表資料)。

3.4 益生菌對幼參體壁營養(yǎng)組成的影響

某些益生菌可以在一定程度上影響魚和蝦的基本營養(yǎng)成分[23-26]。給虹鱒Oncorhynchus mykiss魚苗投喂適宜濃度 (1.2×109～6.1×109CFU/g) 的商用益生菌 (枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌Bacullus licheniformis)63 d，魚苗粗蛋白質(zhì)含量顯著增加[24]。給塞內(nèi)加爾鰨Solea senegalensis幼魚投喂含109CFU/g希瓦氏菌Shewanella sp.Pdp13的飼料8個月，其肌肉總蛋白質(zhì)含量顯著提高[26]。與Bagheri等[24]和 García de La Banda等[26]的研究結(jié)果類似，本研究結(jié)果表明，飼料中添加由梅奇酵母C14+紅酵母H26+芽孢桿菌BC26組成的混合益生菌，可顯著影響幼參體壁粗蛋白質(zhì)、糖分和灰分含量。然而，給幼參投喂含復(fù)合益生菌 (枯草芽孢桿菌+嗜酸乳桿菌+釀酒酵母菌)的飼料，對其體壁營養(yǎng)組成無顯著影響[14]。因此，混合益生菌 (梅奇酵母C14+紅酵母H26+芽孢桿菌BC26)如何影響幼參體壁營養(yǎng)組成機制需要進一步研究。

[1] Ibrahem M D.Evolution of probiotics in aquatic world：potential effects，the current status in Egypt and recent prospectives[J].Journal of Advanced Research，2015，6(6)：765-791.

[2] Zhang Qin，Ma Hongming，Mai Kangsen，et al.Interaction of dietary Bacillus subtilis and fructooligosaccharide on the growth performance，non-specific immunity of sea cucumber，Apostichopus japonicus[J].Fish ＆ Shellfish Immunology，2010，29(2)：204-211.

[3] 李明.混合益生菌對刺參生長、免疫、消化和腸道菌群的影響[D].大連：大連海洋大學(xué)，2014.

[4] Zhao Yancui，Zhang Wenbing，Xu Wei，et al.Effects of potential probiotic Bacillus subtilis T13 on growth，immunity and disease resistance against Vibrio splendidus infection in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus[J].Fish ＆ Shellfish Immunology，2012，32(5)：750-755.

[5] Yan Fajun，Tian Xiangli，Dong Shuanglin，et al.Growth performance， immune response， and disease resistance against Vibrio splendidus infection in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus fed a supplementary diet of the potential probiotic Paracoccus marcusii DB11[J].Aquaculture，2014，420-421：105-111.

[6] Chi Cheng，Liu Jiayan，F(xiàn)ei Shizhou，et al.Effect of intestinal autochthonous probiotics isolated from the gut of sea cucumber(Apostichopus japonicus)on immune response and growth of A.japonicus[J].Fish ＆ Shellfish Immunology，2014，38(2)：367-373.

[7] Yang Zhiping，Sun Jianming，Xu Zhe，et al.Beneficial effects of Metschnikowia sp.C14 on growth and intestinal digestive enzymes of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus[J].Animal Feed Science ＆ Technology，2014，197：142-147.

[8] Ma Yuexin，Liu Zhiming，Yang Zhiping，et al.Effects of Hanseniaspora opuntiae C21 on the growth and digestive enzyme activity of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicas[J].Chinese Journal of Oceanology ＆ Limnology，2014，32(4)：743-748.

[9] Wang Jihui，Zhao Liuqun，Liu Jinfeng，et al.Effect of potential probiotic Rhodotorula benthica D30 on the growth performance，digestive enzyme activity and immunity in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus[J].Fish ＆ Shellfish Immunology，2015，43(2)：330-336.

[10] Yang Zhiping，Sun Jianming，Xu Zhe.Beneficial effects of Rhodotorula sp.C11 on growth and disease resistance of juvenile Japanese spiky sea cucumber Apostichopus japonicus[J].Journal of Aquatic Animal Health，2015，27(2)：71-76.

[11] 劉姣，韓華，孫飛雪，等.餌料中添加芽孢桿菌BC26對刺參幼參消化酶、免疫反應(yīng)和抗病力的影響[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2013，28(6)：568-572.

[12] 楊志平，徐哲，周倩，等.餌料中添加海洋紅酵母(Rhodotorula sp.)C11對幼參消化酶及免疫反應(yīng)的影響[J].漁業(yè)科學(xué)進展，2015，36(6)：107-112.

[13] 張濤，白嵐，李蕾，等.不同添加量的益生菌組合對仿刺參消化和免疫指標(biāo)的影響[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，2009，24(S1)：64-68.

[14] 錢淑媛，王福強，憨素連，等.復(fù)合益生菌粉對刺參生長、體壁成分和消化酶活性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(20)：129-132.

[15] 李明，馬悅欣，劉志明，等.刺參機體酵母菌組成及其拮抗活性的研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2012，27(5)：436-440.

[16] 李璐瑤，孫丕海，包鵬云，等.飼料中添加混合益生菌對刺參幼參免疫反應(yīng)和抗氧化性能的影響[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2016，31(3)：266-271.

[17] Liu Zhiming，Ma Yuexin，Yang Zhiping，et al.Immune responses and disease resistance of the juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus induced by Metschnikowia sp.C14[J].Aquaculture，2012，368-369：10-18.

[18] Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72(1-2)：248-254.

[19] Macey B M，Coyne V E.Colonization of the gastrointestinal tract of the farmed South Africa abalone Haliotis midae by the probionts Vibrio midae SY9，Cryptococcus sp.SS1，and Debaryomyces hansenii AY1[J].Marine Biotechnology，2006，8(3)：246-259.

[20] 聶琴，楊凡，萬龍飛，等.飼料中添加酵母對刺參腸道消化酶活性和腸道微生物的影響[J].中國飼料，2014(17)：42-44.

[21] Macey B M，Coyne V E.Improved growth rate and disease resistance in farmed Haliotis midae through probiotic treatment[J].Aquaculture，2005，245(1-4)：249-261.

[22] 楊志平，孫飛雪，劉志明，等.刺參腸道潛在產(chǎn)酶益生菌的篩選和鑒定[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2013，28(1)：17-20.

[23] El-Haroun E R，Goda A M A-S， Kabir Chowdhury M A.Effect of dietary probiotic Biogen supplementation as a growth promoter on growth performance and feed utilization of Nile tilapia Oreochromis niloticus(L.)[J].Aquaculture Research， 2006，37(14)：1473-1480.

[24] Bagheri T，Hedayati S A，Yavari V，et al.Growth，survival and gut microbial load of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)fry given diet supplemented with probiotic during the two months of first feeding[J].Turkish Journal of Fisheries ＆ Aquatic Sciences，2008，8：43-48.

[25] García de la Banda I，Lobo C，León-Rubio J M，et al.Influence of two closely related probiotics on juvenile Senegalese sole(Solea senegalensis，Kaup 1858)performance and protection against Photobacterium damselae subsp.piscicida[J].Aquaculture，2010，306(1-4)：281-288.

[26] Lobo C，Tapia-Paniagua S，Moreno-Ventas X，et al.Benefits of probiotic administration on growth and performance along metamorphosis and weaning of Senegalese sole(Solea senegalensis)[J].Aquaculture，2014，433：183-195.