張紅蓮， 夏立群， 秦啟偉

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088；2.廣東海洋大學現代生物化學實驗中心，廣東 湛江524088；3.廣東海洋大學深圳研究院，廣東深圳518108；4.廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江 524088；5.華南農業(yè)大學 海洋學院，廣東 廣州510301)

虹彩病毒 (grouper iridovirus，GIV)是一類侵染昆蟲、爬行動物、魚類等生物并能在宿主細胞質形成包涵體的二十面體雙鏈DNA病毒[1]，因其病毒粒子在病毒感染的宿主體內或在純化濃縮的病毒沉淀物中呈周期性間隔的異常整齊排列，形成晶格平面并互相重疊，當有斜射光線照射時呈現藍色或紫色虹彩，故命名為虹彩病毒。隸屬于虹彩病毒科、蛙病毒屬的新加坡石斑魚虹彩病毒 (Singapore grouper iridovirus，SGIV)，是近年嚴重危害中國和東南亞國家石斑魚養(yǎng)殖的一種魚類傳染性病毒，該病毒能誘導石斑魚脾細胞以類凋亡這種無DNA片段化的程序性細胞死亡方式使患病魚脾臟腫大出血，致死率高達90%[2-4]。目前，學界已經完成了關于SGIV的一些基礎研究工作，如病毒的分離鑒定、基因組學、轉錄組學、蛋白組學和快速檢測方法等[5-8]。研究SGIV重要基因的功能，對探索該病毒感染的發(fā)生機制，制定病毒防控策略具有重要的意義。目前，對SGIV重要功能基因的研究已經陸續(xù)在國內外展開[9-16]。

SGIV ORF39L是根據SGIV全基因組轉錄圖譜確定的晚期基因[7]，編碼一個絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是虹彩病毒科核心基因[17]。核心基因所編碼的蛋白可以在宿主細胞內廣泛地進行復制和傳播，在病毒感染過程中具有重要作用。目前，國內外還未見有對SGIV ORF39L基因功能的研究報道。為研究ORF39L在病毒侵染過程中的作用機制，本研究中擬先制備ORF39L表達蛋白的抗體。ORF39L的開放閱讀框長3153 bp，編碼1051個氨基酸，預測的分子量為118.2 ku，序列結構預測表明，ORF39L基因結構龐大，直接將其在大腸桿菌中進行原核表達有一定困難。為此，本研究中利用生物信息學方法預測了ORF39L抗原表位基因片段，在大腸桿菌中進行融合表達，并將表達蛋白純化后制備抗體，利用抗體進行了間接免疫熒光試驗，旨在為進一步研究ORF39L基因在SGIV感染過程中的作用機制提供數據資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細胞、菌株和質粒 新加坡石斑魚虹彩病毒 (SGIV)[2]和GS細胞[18](石斑魚脾細胞，grouper spleen cells)由華南農業(yè)大學海洋學院秦啟偉教授實驗室提供。大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)和表達載體pET32a+購自Novagen公司。

1.1.2 細菌和細胞培養(yǎng)基

LB細菌培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，pH為7.2～7.4，15 g/L瓊脂，定容至1000 mL，高壓滅菌，4℃下保存。LB液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

GS細胞培養(yǎng)基：L15培養(yǎng)基 (Leibovitz's-15 GIBCO購自Invitrogen公司)。

1.1.3 工具酶和試劑 PrimeSTAR DNA聚合酶、限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶、DNA Maker均購自TaKaRa公司；PCR片段純化、DNA凝膠回收及質粒微量提取試劑盒均購自Axygen公司；蛋白Maker購自Fermentas公司；異丙基-B-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、二氨基聯苯胺 (DAB)購自BBI公司；BCA-100蛋白質定量測定試劑盒和鎳瓊脂糖凝膠FF預成柱分別購自上海申能博采公司和北京韋氏博慧色譜科技有限公司；His-Tag單克隆抗體和辣根過氧化物酶 (HRP)-標記的羊抗鼠IgG二抗購自Pierce公司；聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜購自Millinpore公司。

提取病毒 DNA的堿裂解緩沖液：0.2 mol/L NaCO3， 0.3 mol/L NaCl， 0.02 mol/L EDTA。

1.1.4 免疫小鼠及相關試劑 免疫用6周齡雄性BALB/c小鼠，購自廣東省實驗動物中心，為SPF級標準。弗氏完全佐劑 (FCA)和弗式不完全(FIA)佐劑購自Sigma公司。

PBS 溶 液： 8 g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，pH 7.4，用雙蒸水定容至1 L，高壓滅菌，室溫保存。

1.1.5 間接免疫熒光試驗相關試劑 4%的多聚甲醛：稱取4 g多聚甲醛，溶于80 mL雙蒸水，逐步滴加1 moL/L NaOH(約2 mL)，邊加邊搖勻，待其全部溶解后，定容至100 mL，保存于棕色瓶中；異硫氰酸熒光素 (FITC)-羊抗鼠IgG購自美國Sigma公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)購自美國Biotium公司；抗熒光淬滅封片劑購自美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析抗原表位基因 應用DNA Star 5.0軟件分析SGIV VP39蛋白的二級結構、親(疏)水性、柔韌性和表面可及性。采用Jameson-Wolf法分析VP39蛋白的抗原表位，并利用網站http：//www.cbs.dtu.dk/services/Bepipred在線分析VP39蛋白潛在的B細胞蛋白抗原表位。

1.2.2 SGIV總DNA的提取 總DNA的提取方法參考 《分子克隆實驗指南》第三版 (上冊)[19]。

1.2.3 SGIV ORF39L基因原核表達載體的構建和表達 根據 SGIV(基因庫登錄號：AY521625)ORF39L(核苷酸的位置：34262-37417)的序列和質粒pET32a+的MCS酶切位點，采用Primer 5.0軟件設計引物。

pET32a-39Ag1：

上游引物 5′GCCGAATTCATGGCTGATAATCTGAGC3′(EcoRI)；

下游引物 5′GCGCTCGAGTTATACTGGCCCTCCTAC3′(XhoI)。

pET32a-39Ag2：

上游引物 5′GCGGATCCATGGGAGGGCCAGTATATC 3′(BamHI)；

下游引物5′GCGAAGCTTGTTATCTGAACGCGGGTC 3′(HindⅢ)。

引物合成在上海英駿生物技術有限公司完成。

PCR循環(huán)反應條件：95℃下預變性5 min；94℃下變性30 s，52℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共進行33個循環(huán)；最后于72℃下再延伸7 min。反應結束后，將PCR產物純化回收，利用限制性核酸內切酶分別酶切pET32a+質粒和PCR產物后，用T4DNA連接酶連接過夜，次日熱激轉化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定菌落PCR后，將陽性克隆測序，從測序正確的陽性克隆中分別提取質粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2，再次熱激轉化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，將轉化后的BL21(DE3)涂布于LB平板上培養(yǎng)7～8 h，長出的單菌落即為表達融合蛋白的原核重組菌BL21/pET32a-39Ag1和BL21/pET32a-39Ag2。挑取陽性單菌落接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃下以200 r/min震蕩培養(yǎng)8 h活化后，再按照1%(體積比)的比例轉接于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下以200 r/min震蕩培養(yǎng)至菌體濃度OD600nm值約為0.6，加入誘導劑IPTG至終濃度為0.7 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結束后取菌懸液1 mL，以10 000 r/min離心1 min收集菌體，進行SDS-PAGE分析。以上使用的LB平板和LB液體培養(yǎng)基均為含氨芐青霉素濃度為100 μg/mL的選擇培養(yǎng)基。

1.2.4 融合蛋白的純化 參考夏立群等[20]方法。1.2.5 抗血清的制備 將純化好的融合蛋白與等體積的弗氏完全佐劑 (FCA)或弗氏不完全佐劑(FIA)混勻免疫BALB/c小鼠。取6周齡雄性BALB/c小鼠，每只小鼠每次皮下注射約30 μg純化的融合蛋白，首次注射液為蛋白與等體積完全佐劑 (FCA)混勻制備，之后3次注射液為蛋白與等體積弗氏不完全佐劑 (FIA)混勻制備。每隔7 d免疫注射1次，共4次。陰性對照注射液為佐劑加PBS，注射方法同上。末次免疫注射一周后，從小鼠眼球取血，4℃下過夜，次日離心分離血清，于-80℃下分裝保存。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定抗血清效價。

1.2.6 Western-blot蛋白印跡分析 利用誘導表達的重組菌SDS-PAGE電泳進行融合蛋白檢測。經SDS-PAGE電泳后，于4℃條件下，200 mA轉膜約80 min，將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，用TBST(20 mmol/L Tris-HCl+150 mmol/L NaCl+0.05%Tween 20， pH 為7.4)漂洗 3次，每次 5 min。分別加入一抗(1∶5000稀釋的鼠抗 SGIV VP39Ab1血清或鼠抗SGIV VP39Ab2血清)，室溫下封閉孵育2 h，用TBST漂洗3次，每次5 min；再加入二抗 (HRP標記的羊抗鼠IgG，1∶5000稀釋)，室溫下封閉孵育2 h，用TBST漂洗3次，每次5 min；最后加入DAB顯色液，避光顯色30～60 s，水洗終止反應后，觀察顯色條帶，拍照保存，判斷制備的多克隆抗體特異性。利用SGIV感染的GS細胞進行細胞水平檢測的Western-blot方法同上。

1.2.7 間接免疫熒光 (IFAT)試驗 將GS細胞傳代至6孔細胞培養(yǎng)板中的無菌蓋片上。24 h后，接種約1 MOI(感染復數)的SGIV。分別于感染12 h和24 h后，將蓋玻片從培養(yǎng)板中小心取出，以pH為7.4的PBS清洗細胞1次；用4%多聚甲醛固定細胞1 h，以pH為7.4的PBS清洗細胞3次；用冰乙醇 (100%)透化7 min，用PBS清洗細胞2次。以2%牛血清白蛋白 (BSA)室溫下封閉1 h。用1∶75稀釋的抗SGIV VP39鼠血清作為一抗 (同時設以陰性血清為一抗的對照)，37℃下孵育細胞1 h，用PBS清洗細胞4次；用1∶75稀釋的FITC標記羊抗鼠IgG作為二抗，37℃下避光孵育細胞1 h，用 PBS清洗細胞3次；以 DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽) (用PBS稀釋至終濃度1 μg/mL)室溫下避光染核10 min，用PBS清洗細胞3次；再用抗熒光淬滅劑將蓋玻片的細胞面貼在載玻片上，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 預測SGIV ORF39L抗原表位基因片段

橫軸為蛋白質的氨基酸位置，縱軸為杰弗森-沃夫 (Jameson-Wolf)抗原指數。位于橫軸以上連續(xù)的峰值區(qū)間即為潛在的抗原表位，通過DNAStar軟件分析SGIV VP39蛋白的二級結構、親 (疏)水性、柔韌性和表面可及性。從圖1可見，VP39蛋白的二級結構中，α螺旋、β-折疊、轉角和無規(guī)則卷曲從N末端到C末端均有分布，該蛋白的親水性、柔韌性和表面可及性區(qū)域較多。

SGIV VP39蛋白的抗原表位結果如圖2所示，其中，1～1050位氨基酸大部分肽段都可作為潛在的抗原。利用網站 http：//www.cbs.dtu.dk/services/Bepipred在線預測得到的SGIV VP39蛋白的抗原表位肽段有43個，分布位置和軟件分析的結果類似?；谝陨戏治?，選取N末端氨基酸的兩段基因序列39Ag1(1～414 bp)和39Ag2(402～783 bp)分別進行克隆表達和制備抗體。

2.2 SGIV ORF39L抗原表位基因片段克隆

高保真PCR擴增預測的SGIV ORF39L抗原表位基因39Ag1和39Ag2，用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物結果。從圖3可見：在250～500 bp區(qū)間得到了39Ag1和39Ag2的目標帶，與理論結果39Ag1為414 bp、39Ag2為381 bp大小相符合。證明擴增目標帶成功。切膠回收后，將其連接入pET32a+載體，陽性克隆送到上海英駿公司測序，測序結果用Clustalx 1.83軟件與NCBI(美國國立生物技術信息中心 https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)已報道的序列進行比對分析，結果表明，插入基因片段序列正確，將構建成功的重組質粒命名為pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2。

2.3 SGIV ORF39L的原核表達

將pET32a-39Ag1、pET32a-39Ag2質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經IPTG誘導，分別以未經誘導的含重組質粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2的BL21(DE3)菌體作為陰性對照，與未融合重組菌全菌蛋白電泳條帶相比，在分子量約35 ku處均有一條超強蛋白帶的融合蛋白(圖4)，其中，VP 39Ag1蛋白的預計分子量約為15.79 ku，VP 39Ag2蛋白的分子量約為14.94 ku，pET32a+表達的融合標簽為20.4 ku。與預期相符，說明目的蛋白成功表達，對其分別命名為pET32a-VP39Ag1和 pET32a-VP39Ag2。

圖1 SGIV VP39蛋白的二級結構、親水性、柔韌性及表面可及性圖Fig.1 Secondary structure， hydrophilicity， flexibility and surface accessibility of SGIV VP39 protein

圖2 SGIV VP39蛋白的抗原表位分析Fig.2 Analysis of the antigenic index of SGIV VP39 protein

圖3 瓊脂糖凝膠電泳分析39Ag1和39Ag2的PCR產物Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products of 39Ag1 and 39Ag2 genes

2.4 融合蛋白的純化

用SDS-PAGE分析融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2純化的結果如圖5所示。純化的融合蛋白濃度用Bradford法測定，洗脫第一次、第二次和第三次收集液中純化的VP39Ag1融合蛋白濃度分別為 1140.07、 121.31、 11.45 μg/mL，純化的VP39Ag2融合蛋白濃度分別為1129.013、133.310、8.750 μg/mL。由此可見，純化蛋白濃度完全可以用于小鼠免疫。

2.5 Western-blot法檢測制備的多克隆抗體的特異性

ELISA法檢測表明，獲得的 VP39Ab1和VP39Ab2多克隆抗體效價均為1∶15 000。分別用純化的融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2進行SDS-PAGE電泳后轉PVDF膜，用不同小鼠來源的免疫血清作為一抗分別進行孵育，每只小鼠免疫血清孵育一條PVDF膜，Westernblot結果發(fā)現，在分子量為35 ku附近有明顯的條帶 (圖6)，證明所制備的多克隆抗體39Ab1和39Ab2分別對融合蛋白 pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2有特異性。同時，本試驗中用感染了SGIV病毒的GS細胞檢測，結果證實了多克隆抗體39Ab1和39Ab2均能與分子量為118.2 ku的蛋白帶發(fā)生特異反應 (圖7)，說明所制備多克隆抗體在細胞水平上可以檢測VP39蛋白。

圖4 VP39Ag1和VP39Ag2蛋白在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of VP39Ag1 andVP39Ag2 expressed in E.coli BL21

圖5 SDS-PAGE分析融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2純化的結果Fig.5 SDS-PAGE analysis of purification recombinant proteinspET32a-VP39Ag1 productand pET32a-VP39Ag2 product

圖6 Western-blot法分析抗血清39Ab1和39Ab2對融合蛋白pET32a-VP39Ag1 and pET32a-VP39Ag2的特異性Fig.6 Western-blot analysis of the specificity of antiserum 39Ab1 and 39Ab2 to the fusion protein pET32a-VP39Ag1 and pET32a-VP39Ag2

圖7 Western-blot法分析抗血清39Ab1和39Ab2對SGIV VP39蛋白的特異性Fig.7 Western-blot analysis of the specificity of antiserum 39Ab1 and 39Ab2 to SGIV VP39 protein

2.6 間接免疫熒光 (IFAT)試驗

利用制備的VP39多克隆抗體進行間接免疫熒光試驗，以確定VP39參與了SGIV在GS細胞中的裝配。結果發(fā)現，在SGIV感染GS細胞12 h后，就可以在細胞中檢測到VP39的綠色熒光信號，且綠色熒光全細胞分布 (圖8)。而陰性對照細胞中則無綠色熒光出現。隨著時間延長，感染24 h后，VP39分布在病毒裝配區(qū) (病毒加工廠)，說明VP39參與了SGIV病毒的裝配過程。

圖8 間接免疫熒光檢測VP39在SGIV感染GS細胞過程中的表達Fig.8 Indirect Immunofluorescence detection of VP39 in SGIV-infected GS cells at different time

3 討論

本研究中主要著眼于SGIV ORF39L的原核表達、蛋白純化和抗體制備，以及抗體在免疫熒光試驗中的應用。鑒于ORF39L基因結構龐大，直接在大腸桿菌中進行融合表達有一定的困難，為此，本試驗中首先利用生物信息學方法預測SGIV ORF39L抗原表位基因片段，應用DNA Star 5.0軟件子程序Protean分析了SGIV VP39蛋白的二級結構及親 (疏)水性、柔韌性和表面可及性。其中，采 用 Kyte-Doolittle、 Karplus-Schultz、 Emini、Jameson-Wolf方法，分別預測氨基酸的親水性、氨基酸的柔韌性、氨基酸的表面可能性、潛在的B細胞抗原表位。一般來說，蛋白質各氨基酸殘基分為親水殘基和疏水殘基兩類[21]，疏水性殘基一般被埋在蛋白內部，親水性殘基位于蛋白質表面，親水性殘基與蛋白抗原表位有著密切的聯系。Hopp等[22]認為，氨基酸序列中抗原表位存在的區(qū)域一般具有較強親水性；蛋白質抗原構象的多肽鏈骨架具有一定程度的柔韌性，柔韌性強的氨基酸殘基其可塑性大，從與抗體進行嵌合的角度來說，柔韌性高的氨基酸區(qū)域形成抗原表位的可能性較大一些[23]；表面可及性是指蛋白質抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性，表面可及性參數高的氨基酸區(qū)域也更易于構成抗原表位[24]。從VP39蛋白氨基酸序列的親水性、柔韌性和表面可及性方面分析 (圖1)，VP39蛋白具有多個抗原表位。采用Jameson-Wolf法和網站 http：//www.cbs.dtu.dk/services/Bepipred在線分析VP39蛋白潛在的B細胞蛋白抗原表位，也證實了DNA Star 5.0軟件分析的結果，考慮到抗原太小不利于后續(xù)的試驗進行，本試驗中選取了比較大的兩個基因片段在大腸桿菌中進行融合表達、蛋白純化和抗體制備，間接免疫熒光試驗結果表明，依據抗原表位分析結果克隆、表達、免疫后制得的多克隆抗體，能在細胞水平上較好地檢測到VP39蛋白。

虹彩病毒在宿主細胞的細胞核與細胞質中分別進行了其生命周期中的不同復制，對于病毒蛋白在細胞內的定位研究可為其功能研究提供非常有用的參考。有研究表明[25-26]，虹彩病毒感染是通過細胞內吞方式進入宿主細胞內部，在細胞內部分兩個階段 (細胞核階段和細胞質階段)復制：在細胞核內，病毒粒子以甲基化的病毒基因組DNA作模板，利用宿主細胞的II型RNA聚合酶和病毒早期基因復制、轉錄和表達出病毒基因編碼的DNA聚合酶，再通過DNA聚合酶合成的病毒DNA，然后轉運到細胞質，在細胞質內開始第二階段病毒基因組DNA的復制，形成了長的DNA多聯體，最后加工切割成成熟的DNA，當晚期基因轉錄并表達出病毒的結構蛋白后，在細胞質中完成病毒的組裝。成熟的病毒粒子會集中在細胞質的一個或多個病毒裝配區(qū) (viral assembly sites)，也稱為病毒加工廠(viral factory)的地方。在本試驗中，SGIV感染晚期的GS細胞質內VP39在病毒裝配區(qū)處呈現強烈的綠色熒光，與病毒加工廠共定位，說明VP39參與了SGIV的裝配，有可能是病毒的結構蛋白。病毒結構蛋白往往能夠作為病毒的抗原使用，因此，在研究病毒疫苗時應將其作為重要的研究對象。

本研究中通過對SGIV ORF39L基因克隆表達和抗體的制備，為探索SGIV感染石斑魚的致病機理、開發(fā)有效疫苗，以及防治虹彩病毒病害提供了科學依據。

[1] 孫志鵬，徐祥，李強，等.真鯛虹彩病毒遼寧株跨膜蛋白(ORF049L)基因的克隆及表達[J].大連海洋大學學報，2013，28(2)：148-153.

[2] Qin Q W，Lam T J，Sin Y M，et al.Electron microscopic observations of a marine fish iridovirus isolated from brown-spotted grouper，Epinephelus tauvina[J].Journal of Virological Methods，2001，98(1)：17-24.

[3] Qin Q W，Chang S F，Ngoh-Lim G H，et al.Characterization of a novel ranavirus isolated from grouper Epinephelus tauvina[J].Diseases of Aquatic Organisms，2003，53(1)：1-9.

[4] Huang X H，Huang Y H，Ouyang Z L，et al.Singapore grouper iridovirus，a large DNA virus，induces nonapoptotic cell death by a cell type dependent fashion and evokes ERK signaling[J].Apoptosis，2011，16(8)：831-845.

[5] Song W J，Qin Q W，Qiu J，et al.Functional genomics analysis of Singapore grouper iridovirus：complete sequence determination and proteomic analysis[J].Journal of Virology，2004，78(22)：12576-12590.

[6] Song W J，Lin Q S，Joshi S B，et al.Proteomic studies of the singapore grouper iridovirus[J].Molecular and Cellular Proteomics，2006，5(2)：256-264.

[7] Teng Y，Hou Z W，Gong J，et al.Whole-genome transcriptional profiles of a novel marine fish iridovirus，Singapore grouper iridovirus(SGIV)in virus-infected grouper spleen cell cultures and in orange-spotted grouper， Epinephulus coioides[J].Virology，2008，377(1)：39-48.

[8] Mao X L，Zhou S，Xu D，et al.Rapid and sensitive detection of Singapore grouper iridovirus by loop-mediated isothermal amplification[J].Journal of Applied Microbiology，2008，105(2)：389-397.

[9] Wang F，Bi X Z，Chen L M，et al.ORF018R，a highly abundant virion protein from Singapore grouper iridovirus，is involved in serine/threonine phosphorylation and virion assembly[J].Journal of General Virology，2008，89(5)：1169-1178.

[10] Xia L Q，Cao J H，Huang X H，et al.Characterization of Singapore grouper iridovirus(SGIV)ORF086R，a putative homolog of ICP18 involved in cell growth control and virus replication[J].Archives of Virology，2009，154(9)：1409-1416.

[11] Wan Q J，Gong J，Huang X H，et al.Identification and characterization of a novel capsid protein encoded by Singapore grouper iridovirus ORF038L[J].Archives of Virology，2010，155(3)：351-359.

[12] Zhou S，Wan Q J，Huang Y H，et al.Proteomic analysis of Singapore grouper iridovirus envelope proteins and characterization of a novel envelope protein VP088[J].Proteomics，2011，11(11)：2236-2248.

[13] Huang X H，Gong J，Huang Y H，et al.Characterization of an envelope gene VP19 from Singapore grouper iridovirus[J].Virology Journal，2013，10：354.

[14] Zhang H L，Zhou S，Xia L Q，et al.Characterization of the VP39 envelope protein from Singapore grouper iridovirus[J].Canadian Journal of Microbiology，2015，61(12)：924-937.

[15] Wang F，Liu Y，Zhu Y，et al.Singapore grouper iridovirus ORF75R is a scaffold protein essential for viral assembly[J].Scientific Reports，2015，5：13151.

[16] Yuan Y M，Wang Y Z，Liu Q Z，et al.Singapore grouper iridovirus protein VP088 is essential for viral infectivity[J].Scientific Reports，2016，6：31170.

[17] Eaton H E，Metcalf J，Penny E，et al.Comparative genomic analysis of the family Iridoviridae：re-annotating and defining the core set of iridovirus genes[J].Virology Journal，2007，4：11.

[18] Huang X H，Huang Y H，Sun J J，et al.Characterization of two grouper Epinephelus akaara cell lines：application to studies of Singapore grouper iridovirus(SGIV)propagation and virus-host interaction[J].Aquaculture，2009，292(3-4)：172-179.

[19] 薩姆布魯克 J，拉塞爾 D W.分子克隆實驗指南[M].黃培堂，譯.3 版.北京：科學出版社，2002：27-30.

[20] 夏立群，張紅蓮，梁海鷹，等.新加坡石斑魚虹彩病毒ORF086蛋白的原核表達、純化及抗體制備[J].上海海洋大學學報，2010，19(1)：1-6.

[21] 紀鋒，徐黎明，趙景壯，等.鯉春病毒血癥病毒Shlj1株糖蛋白空間結構及其B細胞抗原表位的預測[J].大連海洋大學學報，2017，32(4)：440-446.

[22] Hopp T P，Woods K R.Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1981，78(6)：3824-3828.

[23] Karplus P A，Schulz G E.Prediction of chain flexibility in proteins[J].Naturwissenschaften，1985，72(4)：212-213.

[24] Emini E A，Hughes J V，Perlow D S，et al.Induction of hepatitis a virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide[J].Journal of Virology，1985，55(3)：836-839.

[25] Jancovich J K，Chinchar V G，Hyatt A，et al.Family iridoviridae[M]//King A M Q，Lefkowitz E，Adams M J，et al.Virus taxonomy：ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.San Diego，CA：Elsevier，2012：193-210.

[26] Yamauchi Y，Helenius A.Virus entry at a glance[J].Journal of Cell Science，2013，126(6)：1289-1295.