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        豬流行性腹瀉病毒HB2015分離株N基因表達(dá)及單克隆抗體的制備

        2018-03-07 06:34:05祁光宇趙興緒
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        祁光宇, 劉 斌, 趙興緒

        (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070; 2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司,甘肅 蘭州 730046)

        豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種急性、高度傳播性的豬特別是仔豬腸道疾病,以豬急性腸炎、水樣腹瀉、嘔吐和嚴(yán)重脫水為主要特征[1-2]。中國(guó)在2010年P(guān)EDV出現(xiàn)新的變異株[3]。這些新變異株造成較高的新生仔豬和哺乳豬發(fā)病率和死亡率[4]。PEDV感染不但給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,并且導(dǎo)致國(guó)內(nèi)豬肉價(jià)格上漲。

        PEDV 基因組為單股正鏈 RNA,整個(gè)基因組長(zhǎng)約為 28 Kb,編碼的必須結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)有4種,分別為突蛋白(S)、小膜蛋白(sM)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)[5-6]。PEDV的核心部分是N蛋白與基因組RNA結(jié)合形成的螺旋狀核蛋白體。N蛋白是PEDV已知結(jié)構(gòu)蛋白中唯一的磷酸化蛋白,也是組成病毒核衣殼的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。除此之外,N蛋白還具有保守性強(qiáng)的特點(diǎn),而豬在感染PEDV的早期,體內(nèi)就能產(chǎn)生高水平的抗N蛋白抗體。因而利用N蛋白建立PEDV分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景[7]。豬流行性腹瀉與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒病和細(xì)菌性腹瀉等從臨床癥狀上很難區(qū)分[8],必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能確診。目前,檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的主要方法有反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫組化等[9-10],這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,所以快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷方法對(duì)于豬流行性腹瀉的監(jiān)測(cè)和防控具有重要意義。本研究以原核表達(dá)的N蛋白為基礎(chǔ)制備單克隆抗體,以期為進(jìn)一步研制豬流行性腹瀉病快速診斷方法奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 菌株和主要試劑

        豬流行性腹瀉病毒B2015株由中農(nóng)威特研發(fā)中心分離保存。載體pET-32a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存。T-Vector pMDTM19 (Simple)、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TaKaRa Ex Taq?試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶為寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,One Step RT-PCR Kit、Gel Extraction Kit D2500瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑、Viral RNA Kit為OMEGA公司產(chǎn)品,克隆DH5α感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為全式金公司產(chǎn)品,His-trap HP型鎳離子親和層析柱為GE公司產(chǎn)品。其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

        1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

        根據(jù)國(guó)內(nèi)近幾年豬流行性腹瀉病毒株,參考GenBank中KX016034.1全基因組序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物擴(kuò)增N基因。根據(jù)載體酶切位點(diǎn)的要求,引物分別加入BamH Ⅰ和XhoⅠ位點(diǎn),引物NF序列為5′-AACGGATCCATGGCTTCTGTCAGTTTTCA-3′,,NR為5′-AGACTCGAGTTAATTTCCTGTATCGAAG-3′。引物由大連寶生物工程有限公司合成。

        1.3 病毒總RNA提取與One Step RT-PCR擴(kuò)增

        按照Viral RNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取豬流行性腹瀉病毒B2015株的基因組RNA。以提取的RNA為模板,采用RT-PCR擴(kuò)增N基因。反應(yīng)體系: 5×Reaction buffer 10 μl,Template RNA 10 μl,Sense primer (10 μmol/L) 1 μl,Anti-sense primer (10 μmol/L) 1 μl,M-MLV RTase/TaqDNA Polymerase Mix 1 μl,Nuclease-free water 271 μl。反應(yīng)程序:42 ℃ 30 min,94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,電泳產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。

        1.4 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

        將回收產(chǎn)物連接至T-Vector pMDTM19 (Simple)載體上,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種至含100 μg/ml 氨芐青霉素(Amp+)的LB液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng),提取重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定和測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMDTM19-N和質(zhì)粒pET32a(+)用BamHⅠ和XhoⅠ兩種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,對(duì)兩種酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收后,使用T4 DNA ligase分別連接同樣經(jīng)酶切后的質(zhì)粒pET32a(+)和質(zhì)粒pMDTM19-N,16 ℃連接過(guò)夜。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,并涂布于Amp+LB固體培養(yǎng)基平板中,培養(yǎng)板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落至Amp+LB液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng),提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定、測(cè)序。質(zhì)粒測(cè)序由寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

        1.5 重組N蛋白的表達(dá)、鑒定及純化

        將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET32a-N轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3) Chemically Competent Cell感受態(tài)細(xì)胞,并涂布于Amp+LB平板中,挑取單菌落至Amp+LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化,加入終濃度為1 mmol/L IPTG在37 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)5 h。將不同時(shí)間收集的菌液12 000 r/min離心5 min,棄上清。沉淀用50 μl PBS重懸后加等量的2×SDS凝膠上樣緩沖液,沸水煮10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

        1.6 表達(dá)蛋白純化及動(dòng)物免疫

        將大量表達(dá)的細(xì)菌沉淀用Binding Buffer重懸并用超聲波裂解菌體,離心取上清部分,參照His-trap HP型鎳離子親和層析柱說(shuō)明書(shū)純化蛋白質(zhì)。將所得蛋白質(zhì)免疫6周齡BALB/c小鼠,同時(shí)做空白對(duì)照,在融合前3 d每只小鼠腹腔注射200 μg進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

        1.7 PEDV-N蛋白單抗的制備

        小鼠尾靜脈取血,用ELISA方法測(cè)定各小鼠血清效價(jià),效價(jià)高于1∶10 000的鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按聚乙二醇(PEG)方法進(jìn)行雜交融合。用間接ELISA對(duì)雜交瘤細(xì)胞上清液進(jìn)行篩選,陽(yáng)性孔再經(jīng)過(guò)3次有限稀釋法進(jìn)行亞克隆[11],待陽(yáng)性率達(dá)到100%時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng),用于制備腹水,并保存于液氮。參照文獻(xiàn)[12]制備腹水,待小鼠腹部膨大后抽取腹水,離心取上清液。

        1.8 單克隆抗體Western blot檢測(cè)

        將PEDV感染的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液和SDS處理,進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn),轉(zhuǎn)PVDF膜后封閉。以制備的單克隆抗體反應(yīng)1 h, TBST洗滌后加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG反應(yīng)1 h, TBST洗滌后顯色進(jìn)行鑒定。同時(shí)設(shè)立空質(zhì)粒表達(dá)的菌體蛋白為陰性對(duì)照組。

        1.9 單克隆抗體的間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)

        用PEDV感染接種于24孔細(xì)胞板的Vero細(xì)胞。培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯病變時(shí),先用甲醛固定細(xì)胞,PBS洗滌之后加入PBSA封閉1 h。PBS洗滌后加入制備的單克隆抗體反應(yīng)1 h,PBS洗滌干凈,并加入綠色熒光二抗反應(yīng)1 h,洗滌干凈后進(jìn)行熒光觀察。同時(shí)設(shè)未感染的細(xì)胞作空白對(duì)照。

        2 結(jié) 果

        2.1 PEDV N基因重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-N的鑒定

        對(duì)重組質(zhì)粒pET-32a-N進(jìn)行BamH I、XhoI雙酶切和PCR后進(jìn)行電泳,分別在約6 000 bp和1 326 bp處出現(xiàn)明亮的條帶,與預(yù)期大小一致(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示與標(biāo)準(zhǔn)基因同源性為100%,說(shuō)明已成功構(gòu)建了豬流行性腹瀉病毒N基因原核表達(dá)載體pET-32a-N。

        M:DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 8000;1:重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-N對(duì)照;2:pET-32a-N的Bam H I、Xho I雙酶切;3:N基因的PCR產(chǎn)物。圖1 豬流行性腹瀉病毒N基因重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-N的鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET-32a-N of porcine epidemic diarrhea virus N gene

        2.2 重組N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

        含有重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示有1條分子量約為 6.8×104大小的蛋白質(zhì)條帶,與預(yù)期大小一致,說(shuō)明重組質(zhì)粒在大腸桿菌中成功表達(dá)(圖2)。將純化后的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)印到NC膜上,用豬流行性腹瀉陽(yáng)性血清進(jìn)行Western blotting鑒定。結(jié)果顯示,在分子量約 6.8×104處可見(jiàn)特異性條帶,而菌體蛋白無(wú)條帶(圖3)。

        M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:誘導(dǎo)后的pET-32a(+)空載體;2:未誘導(dǎo)的pET-32a-N/E.coli BL21(DE3)重組菌;3:誘導(dǎo)后的pET-32a-N/E.coli BL21(DE3)重組菌。圖2 重組N蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant N protein

        M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:純化N蛋白。圖3 純化的重組N蛋白Western blotting分析Fig.3 Western blotting analysis of purified recombinant N protein

        2.3 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選

        用ELISA方法篩選得到穩(wěn)定的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。將初步篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞再經(jīng)3次亞克隆,共獲得2株穩(wěn)定分泌抗N蛋白的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為C5D3和H3E7,將其擴(kuò)大培養(yǎng)后保存于液氮備用。

        2.4 單克隆抗體C5D3和H3E7的Western blotting鑒定

        2株單抗C5D3和H3E7均可特異性識(shí)別N蛋白,在分子量約 6.8×104處出現(xiàn)特異性條帶,而與空質(zhì)粒表達(dá)的菌體蛋白不發(fā)生反應(yīng)(圖4)。

        M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:C5D3株;2:H3E7株;3:陰性對(duì)照。圖4 單抗C5D3和H3E7株的Western blotting分析Fig.4 Western blotting analysis of monoclonal antibody of C5D3 and H3E7

        2.5 單克隆抗體C5D3和H3E7的IFA分析

        IFA檢測(cè)結(jié)果顯示,感染PEDV病毒的細(xì)胞出現(xiàn)明顯綠色熒光,而對(duì)照組無(wú)熒光出現(xiàn)(圖5),證明這2個(gè)單抗能特異地識(shí)別和結(jié)合PEDV病毒N蛋白。

        3 討 論

        中國(guó)近幾年P(guān)ED的發(fā)病率、死亡率均呈明顯上升趨勢(shì),特別是從2010年10月以后,PED在中國(guó)廣泛流行并出現(xiàn)新的變異株。感染 PEDV后,哺乳仔豬死亡率可達(dá)80%~100%,但繁殖母豬和公豬感染后很少表現(xiàn)出臨床癥狀。PED大規(guī)模暴發(fā)的最主要原因是病毒的變異,這給PED的防控帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)[13]。

        在PEDV合成過(guò)程中,N蛋白既能與病毒RNA纏繞成為病毒粒子的核衣殼,又能結(jié)合磷脂和細(xì)胞膜,促進(jìn)形成RNA復(fù)合體,對(duì)病毒組裝有重要作用[5-6]。同時(shí)N蛋白的保守性很高,在豬感染早期,機(jī)體就可以產(chǎn)生抗N蛋白抗體,所以N蛋白可以作為早期診斷的靶蛋白,同時(shí)可以用于研制開(kāi)發(fā)抗PEDV的表位疫苗[14]。

        本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建PEDVN基因重組質(zhì)粒pET-30a-N,然后以純化后的PEDV-N蛋白為免疫原免疫小鼠,成功制備了2株抗PEDV的單克隆抗體。經(jīng)ELISA和IFA方法檢驗(yàn),制備的單抗均能與PEDV N蛋白和PEDV結(jié)合。在試驗(yàn)過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)對(duì)雜交瘤細(xì)胞系定期克隆化檢測(cè)抗體水平是很有必要的,其目的是防止雜交瘤細(xì)胞在長(zhǎng)期傳代過(guò)程中喪失分泌抗體的功能,影響后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。對(duì)雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示,2株單抗分泌能力穩(wěn)定性良好,未出現(xiàn)急性下降甚至消失的情況。在制備腹水過(guò)程中發(fā)現(xiàn),C5D3株單抗細(xì)胞產(chǎn)生腹水量很少,H3E7株細(xì)胞產(chǎn)生的腹水量比較多。其中腹水量少的原因:一是于注射石蠟后7 d就注射細(xì)胞,時(shí)間過(guò)早;二是細(xì)胞量過(guò)多也會(huì)引起腹水過(guò)少或不出現(xiàn),出現(xiàn)實(shí)體瘤現(xiàn)象[14]。

        A:C5D3株;B:H3E7株;C:陰性對(duì)照。 圖5 單克隆抗體C5D3和H3E7與感染PEDV的Vero 細(xì)胞IFA 試驗(yàn)Fig.5 The indirect immunofluorescence assay (IFA) of PEDV in Vero cells with monoclonal antibody of C5D3 and H3E7

        快速、準(zhǔn)確以及操作簡(jiǎn)單易行的診斷方法是有效防控疫病的基礎(chǔ)和前提條件。近年來(lái)在PED診斷方法上取得了很大進(jìn)展,目前已經(jīng)有很多新技術(shù)應(yīng)用于PED的診斷,比如ELISA、RT-PCR和免疫熒光技術(shù)[15]。雖然這些檢測(cè)方法準(zhǔn)確率較高,但所需試劑繁多、經(jīng)濟(jì)成本高,且有設(shè)備和技術(shù)要求,難以在基層推廣普及[16]。膠體金免疫層析法(GICA)是近些年發(fā)展起來(lái)的一種以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的新型免疫檢測(cè)技術(shù),可以彌補(bǔ)儀器檢測(cè)方法的不足,在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景[17]。本試驗(yàn)成功制備并鑒定了抗PEDV-N蛋白單克隆抗體,為豬流行性腹瀉病毒金標(biāo)試紙檢測(cè)方法的建立奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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