田節(jié)印，趙麗

（邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056002）

0 引言

隨著我國進(jìn)入老齡化社會(huì)，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病逐年增高，而目前骨關(guān)節(jié)炎的有效手段仍是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)[1]，盡管人工關(guān)節(jié)的材質(zhì)及設(shè)計(jì)一直不斷在改進(jìn)，但假體無菌松動(dòng)仍是影響人工關(guān)節(jié)使用壽命的最主要原因之一[2-3]，而且發(fā)病率居高不下。漢防己甲素是一種雙芐基異喹啉生物堿，具有抗炎、抗高血壓及抗腫瘤等作用，已廣泛應(yīng)用于臨床各個(gè)疾病的治療[4-5]。我們選擇觀察漢防己甲素對(duì)鈦金屬顆粒刺激PBMC釋放IL-12和干擾素-g的情況作為研究對(duì)象，探討漢防己甲素對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)PBMC免疫成熟的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康志愿者采集肘靜脈血，肝素抗凝。采用Ficoll密度梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。淋巴細(xì)胞分離液，10%小牛血清RPMI1640，Hank's液，鈦顆粒（Alfa Aesar公司），IL-12、INF-g酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）、漢防己甲素（臨汾藥業(yè)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DHC-1300-RA-BR超凈工作臺(tái)（蘇州凈化公司），PCR儀（BD公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

1組為陰性對(duì)照組，PBMC+培養(yǎng)基；2組為空白對(duì)照組，PBMC+生理鹽水；3組陽性對(duì)照組，PBMC+0.1%鈦顆粒；4組為漢防己甲素組，分離PBMC+0.1%鈦顆粒+1g/mL漢防己甲素。

1.3.2 細(xì)胞分離及活力檢測(cè)

將采用Ficoll密度梯度離心法獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞加入5倍以上體積的Hank￠s液，1500rpm×10min，洗滌細(xì)胞兩次，末次離心后，棄上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640，重懸細(xì)胞，取一滴細(xì)胞懸液與一滴0.2%臺(tái)盼藍(lán)染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)計(jì)細(xì)胞活力檢測(cè)，活細(xì)胞百分率在95%以上。

1.3.3 鈦顆粒懸液配制

將鈦顆粒用乙醇浸泡消毒后，用無菌PBS配成濃度為0.1%的懸液，用鱟試劑證實(shí)無內(nèi)毒素后儲(chǔ)存在4℃冰箱備用。

1.3.4 培養(yǎng)上清液中的IL-12和干擾素-g水平檢測(cè)

采用雙抗夾心ELISA法，檢測(cè)各組上清液標(biāo)本中IL-12、INF-g水平，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組上清液標(biāo)本中IL-12、INF-g含量的組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子顯示，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，促炎細(xì)胞因子IL-12和干擾素-g的量明顯增多（P＜0.05），而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的IL-12和INF-g的表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；經(jīng)漢防己甲素干預(yù)后，與3組相比，可顯著降低培養(yǎng)上清液中的炎性細(xì)胞因子IL-12和INF-g的含量（P＜0.05），見表 1。

表1 各組對(duì)PBMC表達(dá)IL-12及INF-g的影響

表1 各組對(duì)PBMC表達(dá)IL-12及INF-g的影響

與1組相比，*P＜0.05；與3組相比，…P＜0.05。

25.85±2.73 30.59±11.63 86.49±14.04*57.26±6.84…組別 IL-12含量（pg/mL） INF-g含量（pg/mL）1組2組3組4組13.55±0.56 14.02±0.03 23.16±0.12*19.23±0.01…

3 討論

研究表明，人工假體磨損顆粒釋放的金屬離子刺激假體周圍界膜中的細(xì)胞而釋放出大量炎癥因子[6]，影響免疫細(xì)胞如單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的功能參與假體周圍骨溶解導(dǎo)致假體的無菌性松動(dòng)。根據(jù)研究結(jié)果，理論上可以選擇抑制免疫細(xì)胞功能的藥物來預(yù)防無菌性松動(dòng)。漢防己甲素是雙芐基異喹啉類生物堿，具有廣泛的藥理作用。已有研究表明漢防己甲素可降低炎癥因子的表達(dá)[7]。本研究通過體外觀察鈦顆粒對(duì)PBMC表達(dá)免疫炎性因子IL-12、INF-g的情況及漢防己甲素對(duì)其影響，探討漢防己甲素預(yù)防人工關(guān)節(jié)無菌松動(dòng)的可能。

研究結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，促炎細(xì)胞因子IL-12和干擾素-g的量明顯增多（P＜0.05），而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的IL-12和INF-g的表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；經(jīng)漢防己甲素干預(yù)后，與3組相比，可顯著降低培養(yǎng)上清液中的炎性細(xì)胞因子IL-12和INF-g的含量（P＜0.05）。提示鈦顆粒確可作為刺激因子促進(jìn)免疫炎性細(xì)胞PBMC的成熟，并釋放大量炎性因子IL-12和INF-g，影響關(guān)節(jié)松動(dòng)的發(fā)生；漢防己甲素可通過抑制免疫炎性細(xì)胞成熟，抑制釋放炎性因子，從而預(yù)防關(guān)節(jié)松動(dòng)的形成。

[1] Ingham E, Fisher J. The role of macrophages in osteolysis of total joint replacement.[J]. Biomaterials, 2005,26(11)：1271-1286.

[2] Bozic KJ, Kurtz SM, Lau E, et al. The Epidemiology of Revision Total Hip Arthroplasty in the United States[J]. Clinical Orthopaedics& Related Research?, 2009,91(1)：128-133.

[3] 曹金.漢防己甲素的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].世界臨床藥物 ,2013,11(3)：12.

[4] 牟章兵.漢防己甲素對(duì)離體兔角膜基質(zhì)細(xì)胞抑制機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].眼科研究 ,2007,1(8)：160.

[5] 王國彧.漢防己甲素治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床研究[J].中醫(yī)藥信息 ,2014,6(24)：40.

[6] Goodman SB, Huie P, Song Y, et al. Cellular profile and cytokine production at prosthetic interfaces. Study of tissues retrieved from revised hip and knee replacements.[J]. Journal of Bone & Joint Surgery British Volume, 1998,80(3)：531.

[7] Hauer AD, Uyttenhove C, Vos PD, et al. Blockade of Interleukin-12 Function by Protein Vaccination Attenuates Atherosclerosis[J].Circulation, 2005,112(7)：1054-62.