唐仕華 何 玲 郭莉佳 韋 斌 馮子芳

(興義市人民醫(yī)院，興義 562400)

胍丁胺(Agmatine，AGM)是一種廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)的生物活性胺，是 L-精氨酸-NO 代謝途徑、多胺代謝及多種神經(jīng)信號的重要調(diào)控者。胍丁胺通過與多種受體結合，參與降壓、鎮(zhèn)痛、抗炎、神經(jīng)保護、學習記憶和生長發(fā)育等代謝過程[1,2]。目前在小鼠體內(nèi)胍丁胺對酵母多糖誘導的多器官功能障礙的影響研究尚少。

多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是指患者同時或相繼并發(fā)兩個或兩個以上系統(tǒng)和(或)器官的衰竭或急性功能障礙，常常發(fā)生于急性疾病過程中，也是膿毒癥晚期患者的重要死亡原因。盡管近20年來已有數(shù)十種拮抗致炎因子的藥物進入臨床試驗性治療階段，但副作用大，且療效不如動物體內(nèi)理想，表明上述抗炎措施的安全性或有效性還存在偏差[3-5]。本實驗擬通過建立酵母多糖(Zymosan，ZYM)誘導小鼠MODS模型，旨在體內(nèi)探討胍丁胺對ZYM誘導MODS小鼠的作用和炎癥因子的表達變化，為胍丁胺對MODS的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1MODS動物模型及分組 6～8周齡，體重20～25 g健康雄性KM小鼠165只，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。小鼠進食標準的飼料和飲水，保持正常的12 h晝夜循環(huán)。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。小鼠隨機分為對照組和實驗組，實驗組又分為酵母多糖致傷6 h、12 h、24 h、2 d、5～7 d五個亞組，每組16只。酵母多糖誘導MODS模型的制作參照朱慶磊等[6]的方法。將1 g酵母多糖粉劑(Sigma，美國)與40 ml醫(yī)用石蠟油混合配成25 g/L酵母多糖混懸液，100℃水浴消毒，冷卻至室溫，小鼠腹部消毒，腹腔注射酵母多糖懸液(500 mg/kg)。常規(guī)喂養(yǎng)，觀察死亡率。

1.2方法

1.2.1臟器功能檢測 摘眼球方法采集小鼠血清，肝素抗凝，靜置10 min后3 000 r/min離心10 min取血漿，在全自動生化自動分析儀(奧林巴斯AU5800)上采用酶速率法檢測血漿丙氨酸轉氨酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酐(Cr)、肌酸激酶(CK)、淀粉酶(AMY)的活性或濃度。

1.2.2肺病理組織學檢查 ①將新鮮取出的肺放入4%的多聚甲醛固定24 h，再放入0.5%的多聚甲醛中保存。②將組織塊包埋在石蠟中，并以5 μm厚度切片。③將切片脫蠟和水化(二甲苯Ⅰ10 min；二甲苯Ⅱ10 min；無水乙醇Ⅰ1～3 min；95%乙醇Ⅰ5 min；80%乙醇5 min；75%乙醇5 min；蒸餾水1 min)。④將切片用蘇木精液染色：10 min，流水沖洗去蘇木精液1 min后1%鹽酸-乙醇：1～3 s(顯微鏡下觀察效果)；再用水洗：1～2 s。⑤用1%氨水返藍：10 s后流水沖洗2 min，再用蒸餾水洗 2 min。⑥ 0.5%伊紅液染色1 min，蒸餾水稍洗1～2 s。⑦脫水：75%乙醇2 s；80%乙醇Ⅰ3 min；95%乙醇Ⅱ3 min；無水乙醇Ⅰ5 min；二甲苯Ⅰ 5 min；二甲苯Ⅱ5 min。⑧中性樹膠封固。觀察充血、水腫、炎癥和出血等組織學改變。

1.2.3血清細胞因子水平檢測 采用ELISA方法測定血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的濃度，具體操作步驟按照北京四正柏生物技術公司試劑盒的說明書進行。

1.2.4qPCR檢測腹水TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的表達 用注射器抽取小鼠腹水10 ml，3 000 r/min離心10 min后，棄上清，將沉淀物按照試劑說明書用TRizol法提取總RNA。提出的RNA溶于DEPC水，依照逆轉錄試劑盒(大連TaKaRa生物)說明將RNA反轉錄成cDNA。用實時PCR試劑盒(美國Bio-Rad生物)在實時PCR儀上對cDNA擴增并行實時定量分析。特異性引物使用Primer 4.0合成,引物設計序列見表1。

1.2.5NO濃度測定 腹腔注射24 h后各組眼球取全血，肝素抗凝，靜置10 min后3 000 r/min離心10 min取血漿，按照碧云天總NO檢測試劑盒操作，通過經(jīng)典的Griess reagent檢測亞硝酸鹽從而測定出總NO。

2 結果

2.1MODS病程中不同階段小鼠的癥狀、體征及生存率 ZYM組小鼠3 h后出現(xiàn)精神不振、活動與進食減少，6 h后癥狀加重，表現(xiàn)為拒絕飲食、精神萎靡、腹瀉、全身發(fā)抖、不睜眼且眼分泌物增多；AGM治療組小鼠的一般狀態(tài)也較差，但要明顯好于ZYM組。ZYM注射12 h后，小鼠陸續(xù)出現(xiàn)死亡情況，在觀察期的第7天，大約有79.5%的小鼠發(fā)生死亡，而AGM+ZYM組也在12 h后陸續(xù)出現(xiàn)死亡情況，至觀察期的第7天，小鼠的死亡率62.3%。如圖1生存曲線可以看出，AGM+ZYM組小鼠的死亡率明顯低于ZYM組，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1各引物序列與片段大小

Tab.1Primersequenceandfragmentsize

Gene5′→3′Fragment(bp)TNF?αFP：CGTCGTAGCAAACCACCAAG150RP：TTGAAGAGAACCTGGGAGTAGCAIL?1βFP：CCTCGTGCTGTCGGACCCATA344RP：CAGGCTTGTGCTCTGCTTGTGAIL?6FP：ACCACGGCCTTCCCTACTTC134RP：CTCATTTCCACGATTTCCCAGIL?10FP：CAACATACTGCTAACCGACTCCT173RP：TGAGGGTCTTCAGCTTCTCACβ?actinFP：GAGACCTCAACACCCCAGC256RP：ATGTCACGCACGATTTCCC

2.2MODS小鼠模型肺組織HE染色病理切片結果 肺組織損傷以肺泡增厚，嗜中性粒細胞浸潤及肺泡出血為特征。如圖2所示，對照組或AGM 單獨給予組中的小鼠沒有顯著的形態(tài)學損害，表明腹膜內(nèi)注射鹽水不誘導炎癥反應，AGM對肺組織無毒性反應。然而，在ZYM誘導的小鼠模型中明顯有中性粒細胞浸潤到肺間質，肺泡壁增厚，肺毛細血管擴張、出血、紅細胞大量滲出等現(xiàn)象。胍丁胺處理降低了炎癥細胞浸潤，改善了在ZYM誘導的大鼠肺結構的破壞。充血、水腫、炎癥和出血的情況表明，ZYM誘導的小鼠出現(xiàn)了明顯的急性肺損傷，但胍丁胺處理后均有改善。

圖1 AGM治療對MODS小鼠生存情況的影響Fig.1 Effect of AGM treatment on survival of MODS miceNote: Compared with the ZYM group,*.P<0.05.

2.3酵母多糖致傷對小鼠臟器功能的影響 如表2所示，ZYM組和AGM+ZYM組的小鼠血漿中ALT、AST、Cr、CK和Amy水平與正常對照組相比均明顯升高(P<0.05)；AGM+ZYM組血漿中ALT、AST、Cr、CK和Amy水平與單獨ZYM組相比，均有不同程度的下降，其中ALT、AST、Cr和Amy水平有明顯的降低，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 AGM對肺組織病理改變的影響(HE染色)Fig.2 Effects of AGM on histological change of lung(HE staining)

表2AGM對ZYM誘導的MODS小鼠24h后血清ALT、AST、Cr、CK、Amy水平的影響

Tab.2EffectsofAGMonserumlevelsofALT,AST,Cr,CKandAmyinZYMinducedMODSmiceafter24h

GroupsALT(U/L)AST(U/L)Cr(mmol/L)CK(U/L)Amy(U/L)Control37 3±4 976 8±9 1101 2±22 1361±51 2126 3±36 5AGM52 3±7 558 9±9 897 3±25 1298 5±46 3108 3±31 9ZYM98 6±11 21)207 3±27 4236 2±35 11)986±162 81)462 1±84 21)AGM+ZYM58 6±5 81)2)199 1±19 21)156 7±28 21)2)786±97 51)259 5±95 11)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with ZYM group,2)P<0.05.

圖3 ELISA檢測各組小鼠血細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平Fig.3 Levels of cytokines TNF-α,IL-1β,IL-6 and IL-10 in each group of mice were detected by ELISANote: Compared with control group，*.P<0.05;compared with ZYM group；#.P<0.05.

2.4小鼠血清細胞因子含量的變化 如圖3所示，與正常對照組相比，ZYM組和AGM+ZYM組小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量均明顯升高(P<0.05)；AGM+ZYM組血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量較ZYM組明顯減少(P<0.05)，而血清中IL-10的水平無明顯下降(P>0.05)。

2.5小鼠腹腔滲出液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等基因水平的影響 如圖4所示，對比正常對照組，ZYM組和 AGM+ZYM 組小鼠腹腔滲出液中，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 的含量均明顯升高(P<0.05)；AGM+ZYM 組的TNF-α、IL-1β、IL-6含量卻相較ZYM組有明顯的降低(P<0.05)，IL-10的下降水平卻不明顯。

2.6AGM對小鼠血清內(nèi)NO的影響 如圖5所示，AGM組與對照組小鼠血清NO的產(chǎn)生無明顯差異；與對照組相比，無論是單獨ZYM組，還是AGM+ZYM組，其NO產(chǎn)生明顯增加;而在AGM+ZYM組與單獨ZYM組相比，小鼠血清內(nèi)NO表達量明顯降低(P<0.05)，說明AGM可抑制ZYM誘導的NO產(chǎn)生。

圖4 qPCR檢測腹水TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的表達Fig.4 qPCR was used to detect expression of TNF-α,IL-1β,IL-6 and IL-10 in ascitesNote: Compared with control group，*.P<0.05；compared with ZYM group，#.P<0.05.

圖5 Griess法測定AGM作用24 h后NO的變化Fig.5 Change of NO after AGM effect 24 h were measured by Griess methodNote: Compared with control group，*.P<0.05;compared with ZYM group,#.P<0.05.

3 討論

MODS即多器官功能障礙綜合征，又被稱為多系統(tǒng)器官功能衰竭或多器官衰竭，其以局部和全身性的產(chǎn)生和釋放各種介質為特點，目前普遍認同“細胞因子瀑布效應”學說，即過度炎癥導致 MODS的發(fā)生，但具體機制尚不清楚[7]。相關動物實驗及臨床觀察發(fā)現(xiàn)，MODS病程發(fā)展經(jīng)由早期過度炎癥反應狀態(tài)漸變發(fā)展為后期顯著的免疫抑制[8,9]。因此，在患者病情尚未進入免疫抑制階段對其進行干預，將有助于大幅降低MODS的病死率。

酵母多糖(ZYM)是目前應用較廣泛的建立MODS的模型藥物，其機制是能夠導致無菌性腹膜炎，引起炎癥反應的遷延性失控及過度的激活補體系統(tǒng)，驅動炎性細胞因子參與免疫應答[10]。本研究采用小鼠腹腔注射酵母多糖混懸液建立小鼠MODS模型，其發(fā)病特征與MODS的臨床病患的病程進展極為相似[11,12]。本研究結果顯示，小鼠在注射酵母多糖后，小鼠活動減少，進食減弱甚至不進食，精神萎靡，在不同時間段均出現(xiàn)了死亡，而胍丁胺治療組，小鼠的各項癥狀均有明顯改善，死亡率有明顯的降低。一些研究認為，ZYM是單核細胞和巨噬細胞的強大激活劑，巨噬細胞是其主要作用的靶細胞，其與之接觸后能夠分泌大量炎癥介質(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等)，由此引發(fā)機體過度炎癥反應[10，13-15]。本研究結果顯示小鼠給予酵母多糖后，小鼠體內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10基因和細胞因子均明顯升高，這提示酵母多糖誘導的急性期小鼠器官功能損害部分原因可能是由于上調(diào)了促炎基因表達所致，而在AGM治療組，TNF-α、IL-1β、IL-6卻有明顯下降，這些炎癥因子的下降與AGM調(diào)節(jié)了促炎癥基因的活化和表達有關。另外，本研究觀察到給予酵母多糖后，通過檢測到的器官生化標志物的改變，表明酵母多糖與器官代謝障礙有關。而AGM治療后病情好轉，說明AGM在全身炎癥反應病程中具有器官保護效應。

IL-10是一種有效的抗炎癥因子，與抗原提呈細胞(巨噬細胞、樹突狀細胞)相互作用，從而減少中性粒細胞的聚集，也可以通過NF-κB信號通路，抑制促炎癥因子的產(chǎn)生(如TNF-α、IL-6等)，其在緩解器官損傷中扮演著極其重要的作用[16-19]。實驗表明，ZYM刺激小鼠后，IL-10的含量顯著上調(diào)，而AGM組，IL-10的下降卻不顯著。ZYM刺激小鼠后IL-10的升高是因為機體內(nèi)的抗炎系統(tǒng)發(fā)揮效應，而AGM治療后，IL-10的水平未出現(xiàn)明顯下降，這可能是AGM調(diào)節(jié)了IL-10的表達，抑制了促炎癥因子的產(chǎn)生，這也闡明了IL-10未出現(xiàn)明顯下降，而TNF-α、IL-1β、IL-6明顯下降的原因。因此，IL-10可能是AGM發(fā)揮抗炎作用的一個途徑，但其具體作用和機制還需后續(xù)試驗進行驗證。

本次研究證實了AGM在體內(nèi)能夠顯著抑制促炎癥因子的釋放，在體內(nèi)能夠有效緩解ZYM誘導的實驗性小鼠膿毒癥的嚴重程度，并且能夠減輕急性腹膜炎及肝、腎、胰腺器官的損傷，另外，AGM大大抑制促炎癥因子的產(chǎn)生，維持抗炎因子水平等。AGM抑制炎癥過程可能是通過抑制NF-κB活化從而抑制局部及全身TNF-α、IL-6、NO的產(chǎn)生并且降低嗜中性粒細胞浸潤來實現(xiàn)的，AGM抑制NF-κB活化的分子機制還不明確，需要進一步實驗來證實。這些結果表明AGM可以被認為是一種內(nèi)源性抗炎分子，可能為炎癥性疾病提供了一個新的、有效的治療策略。

[1] Neis VB,Rosa PB,Olescowicz G.Therapeutic potential of agmatine for CNS disorders[J].Neurochem Int，2017，3(5)：6-13.

[2] Popolo A,Adesso S,Pinto A,etal.L-Arginine and its metabolites in kidney and cardiovascular disease[J].Amino Acids,2014,46(10):2271-2286.

[3] Sun X,Jones ZB,Chen XM,etal.Multiple organ dysfunction and systemic inflammation after spinal cord injury:a complex relationship[J].J Neuroinflammation,2016,13(1):260.

[4] Hattori Y,Hattori K,Suzuki T.Recent advances in the pathophysiology and molecular basis of sepsis-associated organ dysfunction:Novel therapeutic implications and challenges[J].Pharmacol Therapeutics,2017,4(3):168-175.

[5] Boyd JH,Fjell CD,Russell JA,etal.Increased plasma PCSK9 levels are associated with reduced endotoxin clearance and the development of acute organ failures during sepsis[J].J Innate Immunity,2016,8(2):211-220.

[6] 朱慶磊,錢小順,楊 潔，等.酵母多糖致老年大鼠多器官功能不全模型細胞因子的變化[J].中國老年學雜志,2007,37(7):618-619.

Zhu QL,Qian XS,Yang J,etal.Changes of cytokines in zymosan induced rat model multiple organ dysfunction model in the elderly[J].Chin J Gerontol,2007,37(7):618-619.

[7] Sauaia A,Moore FA.Postinjury inflammation and organ dysfunction[J].Critical Care Clin,2017,33(1):167-191.

[8] Rosenthal MD.Persistent inflammation,immunosuppression,and catabolism:evolution of multiple organ dysfunction[J].Surgical infections,2016,17(2):167-172.

[9] Rosenthal M,Gabrielli A.The evolution of nutritional support in long term ICU patients:from multisystem organ failure to persistent inflammation immunosuppression catabolism syndrome[J].Minerva Anestesiologica,2016,82(1):84-96.

[10] Volman TJ,Hendriks T.Zymosan-induced generalized inflamma-tion:experimental studies intomechanisms leading to multiple organ dysfunction syndrome[J].Shock(Augusta,Ga.),2005,23(4):291-297.

[11] 李希穎,李景輝.酵母多糖引發(fā)MODS機制及其干預的實驗研究進展[J].海南醫(yī)學,2015,3(23):3514-3516.

Li XY,Li JH.Advances in the experimental study of MODS mechanism and intervention by Saccharomyces cerevisiae[J].Hainan Medical J,2015,3(23):3514-3516.

[12] 鄭金光,白曉東,胡 森.酵母多糖誘導全身炎癥反應及多器官功能障礙綜合征模型的研究進展[J].感染、炎癥、修復,2015,6(2):122-124.

Zheng JG,Bai XD,Hu S.Advances in yeast polysaccharide induced systemic inflammatory response and multiple organ dysfunction syndrome model[J].Infection Inflammation Repair,2015,6(2):122-124.

[13] 張 莉,王曉春,楊根妹，等.酵母多糖致老年SIRS大鼠模型多器官功能及炎癥因子變化的研究[J].上海預防醫(yī)學,2016,(02):104-108.

Zhang L,Wang XC,Yang GM,etal.Study on the changes of multiple organ function and inflammatory factors in old SIRS rat model induced by yeast polysaccharide[J].Preventive Med Shanghai,2016,9(2):104-108.

[14] Miyasato M,Taguchi K,Tsuda S,etal.Eosinophil chemilu-minescence response to cytokines and opsonized zymosans in atopic dermatitis[J].International Archives Allergy Immunol,1994,104(Suppl 1):24-26.

[15] 馬淑芹,劉印華,葛淑芝，等.酵母多糖對免疫功能的影響[J].河北醫(yī)藥,2013,11(15):2245-2246.

Ma SQ,Liu YH,Ge SZ,etal.Effects of Saccharomyces cerevisiae on immune function [J]. Hebei Med,2013,11(15):2245-2246.

[16] Li JJ.Effects of 4 weeks of atorvastatin ad ministration on the antiinflammatory cytokine interleukin-10 in patients with unstable angina[J].Clin Chem,2005,51(9):1735-1738.

[17] 張英杰,禹 麗,郝曉娜,等.間充質干細胞與白細胞介素10對四氯化碳誘發(fā)的肝纖維化大鼠的治療作用[J].中國免疫學雜志,2016,32(1):23-28.

Zhang YJ，Yu L，Hao XN，etal.Treatment of experimental hepatic fibrosis in rats by transplanting with mesenchymal stem cells deri[J].Chin J Immunol,2016,32(1):23-28.

[18] Salim PH,Jobim M,Bredemeier M,etal.Interleukin-10 gene promoter and NFKB1 promoterinsertion/deletion polymorphisms in systemic sclerosis[J].Scandinavian J Immunol,2013,77(2):162-168.

[19] 屈玉蘭,鄧捷文,鄧常文,等.白細胞介素10通過抑制自噬調(diào)節(jié)樹突狀細胞功能[J].中國免疫學雜志,2017,33(3):333-337.

Qu YL,Deng JW,Deng CW,etal.Interleukin-10 regulates functions of dendritic cell through autophagy inhibition[J].Chin J Immunol,2017,33(3):333-337.