劉 賽 陳少芬 李文林 石小玉

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南昌 330006)

乳腺癌是女性常見癌癥，是導(dǎo)致女性因癌癥死亡的最主要原因[1,2]。自2000年以來，女性乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)增長[3,4],在中國，乳腺癌是45歲以下女性癌癥死亡的主要原因，其死亡率呈上升趨勢[5]。乳腺癌是多因素、多因子參與的疾病，其發(fā)病原因和機制較為復(fù)雜，需深入研究。TP53誘導(dǎo)型糖酵解和細胞凋亡調(diào)節(jié)劑(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR)是腫瘤代謝調(diào)節(jié)因子和凋亡抑制蛋白,TIGAR能降低細胞中的果糖-2,6-二磷酸水平，導(dǎo)致糖酵解的抑制和細胞內(nèi)活性氧水平的降低，從而保護細胞免受ROS相關(guān)凋亡[6]。B-cell lymphoma-2(Bcl-2)是Bcl家族中最主要的凋亡抑制蛋白，參與腫瘤細胞的凋亡調(diào)節(jié)[7]，靶向Bcl-2是腫瘤分子治療需探索的一條新途徑[8,9]。成纖維細胞是腫瘤間質(zhì)微環(huán)境中主要細胞，對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用[10,11]，本文研究了成纖維細胞與乳腺癌細胞共生長條件下，成纖維細胞對乳腺癌細胞TIGAR和Bcl-2的表達及對乳腺癌生長的影響，試圖為乳腺癌的發(fā)病機制研究提供新資料。

1 材料與方法

1.1主要實驗材料 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購于中科院上海細胞資源中心，人皮膚成纖維細胞株CCC-ESF-1(ESF)購自中國醫(yī)科院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心，雌性裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司(許可證號SCXK滬2012-0002)，胎牛血清(Wisent生物技術(shù)中國有限公司)，DMEM-H培養(yǎng)基(美國Life Tech-Gibco公司)，RevertAid first strand cDNA 試劑盒(美國 Thermo Fisher 公司),qPCR試劑IQSYBRGreen Supermix(美國Bio-Rad 公司),RNA提取試劑盒(上海吉瑪生物公司),相關(guān)基因引物(上海吉瑪生物公司),鼠抗β-actin單克隆抗體 (北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司),鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(美國Bioworld公司),鼠抗人TIGAR單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),羊抗鼠Ig(美國Santa Cruz公司)，一步法聚合物 PV6002試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)，孔徑0.4 μm Transwell小室(美國Corning公司),Caspase-3活性熒光檢測試劑盒和Annexin V凋亡試劑盒(Abcam中國分公司)等。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及共培養(yǎng) 將MDA-MB-231細胞和ESF細胞放入含10%胎牛血清的DMEM-H 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，維持飽和濕度，待細胞生長至80%～90%匯合時，進行傳代培養(yǎng)。實驗分為三組：ESF單獨培養(yǎng)組、ESF+MDA-MB-231共培養(yǎng)組、MDA-MB-231單獨培養(yǎng)組。用6孔板和Transwell小室對ESF細胞和MDA-MB-231細胞進行體外共培養(yǎng)，小室接種細胞量為1.5×105/室，6孔板接種細胞量為2×105/孔。

1.2.2RT-qPCR實驗 用Trizol 法提取細胞總RNA，取2 μl 提取的RNA溶液，用分光光度計檢測，觀察A260/A280、A260/A230 比值及連續(xù)波長吸收峰，計算RNA 溶液濃度，判斷RNA 提取質(zhì)量，2.3>A260/A280>2.0時，可用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄實驗。以β-actin為內(nèi)參，β-actin引物：上游引物5′-GAGAAAATCTGGCACACC-3′,下游引物5′-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA-3′；Bcl-2引物：上游引物5′-CACCCCCTCGTCCAAGAATG-3′，下游引物 5′-GCCACTCGTAGCCCCTCTGC-3′；TIGAR引物：上游引物5′-CAGCGGTATTCCAGGATTAG-3′，下游引物5′-ACCTTAGCGAGTTTCAGTCAG-3′。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存cDNA。熒光定量PCR 擴增實驗，反應(yīng)條件：50℃ 3 min，95℃ 3 min；95℃ 10 s，55℃20 s(Bcl-2:63.5℃ 20 s),72℃ 30 s，40個循環(huán)；溶解曲線溫度65～95℃。實驗結(jié)果由熒光定量PCR軟件Bio-Rad CFX Manager自動進行統(tǒng)計和計算分析。

1.2.3Western blot實驗 PBS分別洗滌細胞后用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下5%脫脂奶粉搖床封閉3 h，分別加入β-actin一抗、TIGAR一抗和Bcl-2一抗，4℃過夜孵育一抗，加入二抗并于搖床上室溫孵育1～2 h，ECL顯色曝光，觀察并拍照，用Image J軟件分析各條帶光密度 。

1.2.4Annexin V凋亡實驗 收集細胞，每一實驗樣本細胞數(shù)量為1×105，實驗組每管加5 μl Annexin V-Biotin ,對照組每管加5 μl 7-amino-actinomycin(7-AAD)，用7-AAD以區(qū)別凋亡細胞與其他死細胞，室溫避光孵育 15 min；再在實驗組每管中加入Streptavidin-FITC，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測。

1.2.5Caspase-3活性熒光檢測實驗 提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量,實驗設(shè)空白對照孔和待測樣品孔，均加入含熒光底物AC-DEVD-AMC的Caspase-3反應(yīng)緩沖液(45 μl /孔)，空白每孔加5 μl細胞裂解液(含Cocktail)，待測樣品每孔加10 μg(5 μl)細胞總蛋白，熒光分光光度計檢測AMC釋放量，分析熒光強度。

1.2.6人乳腺癌裸鼠移植瘤模型的建立 取6～7周齡雌性裸鼠，隨機實驗分組：①ESF+MDA-MB-231組；② MDA-MB-231組；③ESF組，分別向每組裸鼠右側(cè)胸壁第二乳腺注入100 μl細胞懸液(MDA-MB-231細胞濃度為2×106、ESF細胞濃度為0.5×106)。每隔1 d用游標卡尺測量瘤體的最長徑(a)和最短徑(b)，以腫瘤長徑達5 mm為成瘤(成瘤約在細胞接種后的7 d左右)。 根據(jù)公式計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線,腫瘤的體積計算公式：V(mm3)=1/6πab2。在裸鼠成瘤30 d后將裸鼠頸椎脫臼處死，取出腫瘤組織放入4%福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋切片，HE染色和免疫組織化學(xué)實驗。

1.2.7裸鼠移植瘤組織HE染色 石蠟切片經(jīng)脫蠟至水后，用蘇木素-伊紅(HE)常規(guī)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8裸鼠移植瘤組織免疫組織化學(xué)實驗 石蠟切片脫蠟至水，滴加3%H2O2，37℃孵育10 min，置入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)中，入微波爐修復(fù)抗原，正常羊血清工作液封閉37℃正常血清工作液作用30 min，滴加一抗4℃孵育過夜，室溫平衡30 min，滴加相應(yīng)二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照，Image-Pro Plus軟件分析。

2 結(jié)果

2.1與成纖維細胞共培養(yǎng)的乳腺癌細胞TIGAR和Bcl-2表達上調(diào) RT-qPCR實驗檢測乳腺癌細胞MDA-MB-231的TIGAR和Bcl-2 mRNA表達，結(jié)果如圖1所示，與MDA-MB-231細胞單獨培養(yǎng)組比較，MDA-MB-231細胞+ESF細胞共培養(yǎng)組TIGAR mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.05)，是單獨培養(yǎng)組的1.53倍；共培養(yǎng)組MDA-MB-231細胞Bcl-2 mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.05)，是單獨培養(yǎng)組的1.44倍。Western blot實驗檢測MDA-MB-231細胞TIGAR和Bcl-2的蛋白表達，結(jié)果如圖2所示，與MDA-MB-231細胞單獨培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)組MDA-MB-231細胞TIGAR和Bcl-2蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05),分別是單獨培養(yǎng)組的1.49和1.81倍。上述結(jié)果說明乳腺癌微環(huán)境的成纖維細胞能上調(diào)乳腺癌細胞抗凋亡因子TIGAR和Bcl-2 mRNA和蛋白的表達。

圖1 RT-qPCR檢測體外培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞抗凋亡因子TIGAR和Bcl-2 mRNA的表達Fig.1 mRNA expression of TIGAR and Bcl-2 in MDA-MB-231 cells detected by RT-qPCR in vitro Note: *.P<0.05.

2.2與成纖維細胞共培養(yǎng)的乳腺癌細胞凋亡下降在與成纖維細胞ESF共培養(yǎng)條件下，乳腺癌細胞MDA-MB-231的抗凋亡因子TIGAR和Bcl-2表達上調(diào)。MDA-MB-231細胞Caspase-3凋亡蛋白酶活性實驗結(jié)果顯示(圖3A)，MDA-MB-231細胞+ESF細胞共培養(yǎng)組MDA-MB-231細胞Caspase-3熒光強度顯著低于MDA-MB-231細胞單獨培養(yǎng)組(P<0.05)，表明在ESF細胞共培養(yǎng)的微環(huán)境下乳腺癌細胞Caspase-3活性降低，這將有利于乳腺癌細胞生長。Annexin V細胞凋亡實驗結(jié)果顯示(圖3B)，與單獨培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)組早期凋亡的MDA-MB-231細胞下降了2.12倍(4.85/2.29)，說明乳腺癌微環(huán)境的成纖維細胞通過上調(diào)乳腺癌細胞抗凋亡因子TIGAR和Bcl-2的表達從而抑制乳腺癌細胞的凋亡。

圖2 Western blot檢測體外培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞抗凋亡因子TIGAR和Bcl-2蛋白的表達Fig.2 Protein expression of TIGAR and Bcl-2 in MDA-MB-231 cells detected by Western blot in vitroNote: A.The electrophoretic bands of TIGAR and Bcl-2 proteins in each group detected by Western blot;B.The optical density of electrophoretic bands of TIGAR and Bcl-2 proteins in each group analyzed by Image J; *.P<0.05.

圖3 Caspase-3活性和Annexin V檢測MDA-MB-231 細胞凋亡Fig.3 MDA-MB-231 cell apoptosis detected by Caspase-3 activity and Annexin VNote: A.Caspase-3 activity in MDA-MB-231 cells detedted by fluorescence;B.MDA-MB-231 cell apoptosis detected by Annexin V and flow cytometry; *.P<0.05.

2.3裸鼠移植瘤微環(huán)境的成纖維細胞促進腫瘤生長 將ESF細胞和MDA-MB-231細胞接種于6～7周的雌性裸鼠右側(cè)胸壁第二乳腺，第5天，可在ESF+MDA-MB-231組和MDA-MB-231組的裸鼠乳腺觸及腫瘤小結(jié)節(jié)，7～10 d腫瘤最長徑達5 mm，成瘤率為100%，人乳腺癌裸鼠荷瘤模型構(gòu)建成功(圖4A)。第30天，將荷瘤裸鼠頸椎脫臼處死，取瘤組織塊,制成石蠟切片，HE染色。400倍顯微鏡下觀察，可見正常乳腺小葉結(jié)構(gòu)消失，細胞聚集成巢，排列紊亂，核大，出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)的異型性,HE染色證實為癌組織(圖4B)。在接種后的第1天至第16天ESF+MDA-MB-231組與MDA-MB-231組的腫瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),自第18天起ESF+MDA-MB-231組的腫瘤體積較MDA-MB-231組大(圖5和表1)，表明成纖維細胞與乳腺癌細胞共同移植入雌性裸鼠乳腺內(nèi)所形成的腫瘤生長快于乳腺癌細胞單獨移植，裸鼠移植瘤微環(huán)境成纖維細胞具有促進腫瘤生長的作用。

圖4 人乳腺癌荷瘤裸鼠移植瘤Fig.4 Human breast cancer-transplanted tumor in nude miceNote: A.The transplanted tumor in nude mice;B.The transplanted tumor tissues stained by HE (×400).

圖5 人乳腺癌裸鼠移植瘤生長曲線Fig.5 Growth curve of human breast cancer-transplanted tumor in nude mice

圖6人乳腺癌荷瘤裸鼠移植瘤組織TIGAR的表達

Fig.6ExpressionofTIGARofhumanbreastcancer-transplantedtumortissuesinnudemice

Note: A.The immunohistochemical optical micrograph (×400) of TIGAR in the transplanted tumor tissues of ESF+MDA-MB-231 groups;B.The immunohistochemical optical micrograph (×400) of TIGAR in the transplanted tumor tissues of MDA-MB-231 groups;C.The optical density of immunohistochemical staining of TIGAR in the transplanted tumor tissues of ESF+MDA-MB-231 groups and MDA-MB-231 groups analyzed by Image-pro-plus 5.1 software; *.P<0.05.

Group10d12d14d16d18d20dESF+MDA?MB?231(n=16)65 11±10 0979 86±21 65107 51±37 01128 55±41 96159 02±53 891)188 32±68 621)MDA?MB?231(n=16)64 96±11 1280 07±22 01105 67±38 32125 01±38 32138 22±47 04156 66±58 23Group22d24d26d28d30dESF+MDA?MB?231(n=16)229 98±87 781)268 83±96 541)312．17±105 691)359 21±116 721)432 09±127 861)MDA?MB?231(n=16)176 47±61 36211 56±73 35243 85±89 06285 36±99 01325 77±106 54

Note：Compared with MDA-MB-231 group,1)P<0.01.

圖7人乳腺癌荷瘤裸鼠移植瘤組織Bcl-2的表達

Fig.7ExpressionofBcl-2ofhumanbreastcancer-transplantedtumortissuesinnudemice

Note: A.The immunohistochemical optical micrographs (×400) of Bcl-2 in the transplanted tumor tissues of ESF+MDA-MB-231 groups;B.The immunohistochemical optical micrographs (×400) of Bcl-2 in the transplanted tumor tissues of MDA-MB-231 groups;C.The optical density of immunohistochemical staining of Bcl-2 in the transplanted tumor tissues of ESF+MDA-MB-231 groups and MDA-MB-231 groups analyzed by Image-pro-plus 5.1 software; *.P<0.05.

2.4TIGAR和Bcl-2在人乳腺癌裸鼠移植瘤組織的表達 免疫組化實驗檢測TIGAR和Bcl-2在裸鼠移植瘤組織中的表達,TIGAR和Bcl-2的陽性結(jié)果為細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒 (圖6A、B和圖7A、B)。每組隨機選取5張切片，每張切片選擇5個不同視野在×400倍光學(xué)顯微鏡下進行觀察拍照，采用Image-pro-plus 5.1軟件測量兩組移植瘤組織切片TIGAR和Bcl-2的光密度，計算平均光密度，結(jié)果顯示(圖6C和圖7C)，與MDA-MB-231組比較，ESF+MDA-MB-231組移植瘤組織TIGAR和Bcl-2的平均光密度值大(P<0.05)，ESF+MDA-MB-231組荷瘤裸鼠移植瘤組織中TIGAR和Bcl-2的表達顯著高于MDA-MB-231組移植瘤組織。表明乳腺癌細胞與成纖維細胞共生長的微環(huán)境可促進移植瘤組織TIGAR和Bcl-2的表達。

3 討論

癌癥的發(fā)生和發(fā)展不僅與腫瘤本身惡性增殖和侵襲等有關(guān)，還與它所處的微環(huán)境即腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)[12]。腫瘤微環(huán)境包括細胞外基質(zhì)、成纖維細胞(癌相關(guān)成纖維細胞，CAFs)、血管、免疫細胞和因子等[13]。其中成纖維細胞占腫瘤微環(huán)境的大部分，它通過分泌細胞因子和對細胞外基質(zhì)的修飾等方式作用腫瘤細胞，對腫瘤的生長起著重要作用[14,15]。為了模擬乳腺腫瘤微環(huán)境，我們采用Transwell 方法，將人乳腺癌細胞MDA-MB-231與人成纖維細胞ESF在同一培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)，但細胞不互混，建立了人乳腺癌細胞與人成纖維細胞體外共培養(yǎng)模型；將人乳腺癌細胞MDA-MB-231與人成纖維細胞ESF共同植入裸鼠乳腺內(nèi)，建立了人乳腺癌細胞與人成纖維細胞體內(nèi)共生長模型。通過體內(nèi)體外模擬的乳腺腫瘤微環(huán)境模型，研究成纖維細胞對乳腺癌細胞TIGAR和Bcl-2表達的影響及對乳腺癌生長的影響。

在惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中，抑制癌細胞凋亡起著重要作用。Bcl家族在細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用，Bcl家族的表達和調(diào)控是影響細胞凋亡的關(guān)鍵因素之一[16,17]。Bcl-2是Bcl家族中最主要的凋亡抑制蛋白,與多數(shù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),通過抑制細胞凋亡和抵抗其他形式的細胞死亡導(dǎo)致細胞數(shù)增多，對腫瘤的生長具有促進作用[18]。TIGAR是一凋亡抑制因子，可導(dǎo)致細胞內(nèi)糖酵解下降和糖有氧氧化下降，減少ROS(活性氧族)的產(chǎn)生，保護細胞免于ROS相關(guān)的凋亡,在氧化應(yīng)激下TIGAR可降低自噬水平促進細胞存活，在能量限制下，可以通過增加呼吸率提升能量供給，減少饑餓誘導(dǎo)的細胞死亡[19,20]。

本研究體外實驗結(jié)果顯示，在共培養(yǎng)條件下，成纖維細胞能上調(diào)乳腺癌細胞TIGAR和Bcl-2的表達，RT-qPCR和Western blot的實驗結(jié)果相互印證。隨后研究了TIGAR和Bcl-2表達上調(diào)對乳腺癌細胞凋亡的影響，采用Annexin V-Biotin流式細胞術(shù)和Caspase-3活性熒光檢測乳腺癌細胞凋亡，實驗結(jié)果顯示，成纖維細胞+乳腺癌細胞共培養(yǎng)組的乳腺癌細胞凋亡低于乳腺癌細胞單獨培養(yǎng)組，表明腫瘤微環(huán)境的成纖維細胞通過上調(diào)乳腺癌細胞TIGAR和Bcl-2的表達從而抑制乳腺癌細胞凋亡促進腫瘤生長。我們的體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，成纖維細胞+乳腺癌細胞共生長組的荷瘤裸鼠乳腺癌組織TIGAR和Bcl-2的表達上調(diào)，成纖維細胞與乳腺癌細胞共同移植入雌性裸鼠乳腺內(nèi)所形成的腫瘤體積大于乳腺癌細胞單獨移植，表明基質(zhì)成纖維細胞可促進乳腺癌細胞生長，且涉及乳腺癌微環(huán)境成纖維細胞上調(diào)乳腺癌細胞的抗凋亡因子TIGAR和Bcl-2的表達，TIGAR和Bcl-2的高表達致使荷瘤裸鼠乳腺癌生長加快。

綜上所述，乳腺癌微環(huán)境成纖維細胞可上調(diào)乳腺癌細胞TIGAR和Bcl-2的表達，促進TIGAR和Bcl-2的抗凋亡作用，從而加快乳腺癌的生長。乳腺癌微環(huán)境成纖維細胞上調(diào)乳腺癌細胞TIGAR和Bcl-2表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有待進一步研究。

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