陳 晨 張俊愛(ài) 劉雨晴 徐 歡 羅厚龍 李瑞曦 鄭碧英 徐軍發(fā)

(廣東醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，東莞 523808)

結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是主要由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)通過(guò)空氣經(jīng)呼吸道傳播后感染而引起的傳染性疾病，可嚴(yán)重危害人類健康[1]，據(jù)WHO發(fā)布數(shù)據(jù)顯示2015年全球約140萬(wàn)人死于結(jié)核病，我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家[2]。結(jié)核病患者多潛伏感染，呈慢性遷延又易復(fù)發(fā)，現(xiàn)有疫苗接種效果欠佳以及耐藥性結(jié)核菌逃逸機(jī)體抗結(jié)核免疫機(jī)制尚未明確[3-5]。 單核巨噬細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是MTB在體內(nèi)的主要宿主,也是作為機(jī)體抗結(jié)核免疫的第一道防線[6],單核細(xì)胞極具異質(zhì)性，可分泌高水平的炎癥因子，如TNF-α和IL-12等，促進(jìn)抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化[7-9]。結(jié)核菌感染后，患者外周血單核細(xì)胞可以快速進(jìn)入組織器官中分化為巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞并在炎癥周圍抑制或清除體內(nèi)的MTB[10]，活化的單核細(xì)胞可產(chǎn)生負(fù)向免疫調(diào)節(jié)因子IL-35[11]，白介素35(Interleukin-35，IL-35)是一種新發(fā)現(xiàn)的起負(fù)向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子[12-14]，主要由P35和EBI3兩個(gè)亞基組成，屬于IL-12家族成員[15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血IL-35水平顯著升高，產(chǎn)IL-35的T細(xì)胞增高，且BCG刺激可致患者IL-35表達(dá)增加，提示IL-35參與結(jié)核免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，但有關(guān)產(chǎn)IL-35單核細(xì)胞在抗結(jié)核免疫中的作用未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選取易建立MTB感染且臟器荷菌量相對(duì)較高的C57BL/6小鼠[16]，尾靜脈注射卡介苗(BCG)建立結(jié)核菌感染動(dòng)物模型,于不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)外周血和肺組織中產(chǎn)IL-35單核細(xì)胞數(shù)，分析其于肺組織中載菌量的相關(guān)性，探討產(chǎn)IL-35單核細(xì)胞在結(jié)核免疫防衛(wèi)中作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑和儀器 流式抗體為EBI3-APC(R&D,IC18341A),P35-FITC(R&D,IC2191F),小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液、小鼠組織分離液購(gòu)自TBDsciences公司，F(xiàn)ACS-VerseⅡ流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品，其他器材包括倒置熒光顯微鏡、生物安全柜、切片機(jī)、BCG(美國(guó)University of Illinois at Chicago陳維政教授提供)、羅氏培養(yǎng)基(貝索)、抗酸染色試劑盒(貝索)、HE染色試劑盒等。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)的C57BL/6J雌性小鼠，6～8周齡，體重16～18 g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，具廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明[許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0041]。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠模型制備 將C57BL/6J小鼠平均分為BCG感染實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組以每只2×106CFU/200 μl劑量經(jīng)尾靜脈途徑感染BCG,對(duì)照組注射200 μl生理鹽水，小鼠感染后分別在2、4、8周摘眼球取血、解剖獲取肺臟，進(jìn)行組織荷菌量、病理及細(xì)胞因子流式分析，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取6～7只小鼠，各組間注意小鼠周齡、體重、生理狀態(tài)等相匹配。

1.2.2組織荷菌量 無(wú)菌條件下取小鼠左下葉肺組織0.04 g，加1 ml生理鹽水于玻璃勻漿器中充分研磨，再用等體積4%NaOH消化30 min后作倍比稀釋(10-1和原液)，吸取100 μl肺組織勻漿液接種于羅氏固體斜面培養(yǎng)基，37℃孵箱培養(yǎng)4～5周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.3病理學(xué)檢測(cè) 小鼠肺組織用10%甲醛固定,常規(guī)梯度酒精脫水，代替二甲苯安全液透明，軟蠟硬蠟各浸泡1.5 h后將組織塊包埋。切片機(jī)調(diào)節(jié)切片厚度為4～6 μm,烘片后不同濃度酒精脫蠟，進(jìn)行蘇木素伊紅染色，另取部分切片抗酸染色，顯微鏡下觀察肺組織病變情況并中性樹脂封片。

1.2.4外周血和肺組織單個(gè)核細(xì)胞的分離 稀釋0.05%(w/v)膠原酶和0.01%(w/v)胰蛋白酶抑制劑于RPMI1640液制成酶解液，剪碎小鼠肺組織并加入稀釋過(guò)的膠原酶，37℃消化30 min，用5 ml組織勻漿液研磨組織后用200目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾到離心管內(nèi)，500 g離心15 min，棄上清，樣本稀釋液懸浮沉淀為單細(xì)胞懸液。用吸管小心吸取組織單細(xì)胞懸液和肝素抗凝外周血于等量的分離液液面上，450 g離心30 min后吸取單個(gè)核細(xì)胞層。

1.2.5單核細(xì)胞P35、EBI3表達(dá)的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)P35與EBI3在單核細(xì)胞中的表達(dá)，取100 μl含1×106個(gè)外周血或肺組織單個(gè)核細(xì)胞于流式管中，每管加200 μl破膜劑(BD Cytofix/Cytoperm)4℃避光反應(yīng)20 min，用1 ml清洗液(1×BD Perm/Wash)1 500 r/min，5 min洗滌2次，倒掉上清并控干后加入推薦量熒光標(biāo)記的抗體(EBI3-APC、P35-FITC)10 μl，振蕩混勻，室溫避光孵育30 min；再次洗滌2次，棄上清，最后加入200 μl 2%多聚甲醛溶液固定，上流式細(xì)胞儀分析，根據(jù)前向和側(cè)向散射兩個(gè)物理參數(shù)圈定單核細(xì)胞，再根據(jù)熒光波長(zhǎng)分析P35和EBI3在單核細(xì)胞中的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1肺組織病理學(xué)分析和荷菌量檢測(cè) 小鼠肺組織病理切片主要表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)塌陷破壞，肺泡腔內(nèi)充滿以中性粒細(xì)胞為主，伴單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)的炎性病變，紅細(xì)胞滲出明顯；抗酸染色示肺泡周圍分枝桿菌為散在細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲的紅色桿菌。解剖小鼠取肺組織左下葉進(jìn)行細(xì)菌負(fù)載量分析，發(fā)現(xiàn)小鼠感染后2周肺部荷菌量達(dá)到(5.529±0.246 1)log10CFU，在感染后4周下降至(4.911±0.336 9)log10CFU，感染后8周又顯著升高到(6.550±0.272 4)log10CFU(P<0.001)，見圖1。

2.2P35在BCG感染小鼠外周血與肺組織中單核細(xì)胞內(nèi)高表達(dá) 對(duì)BCG感染小鼠外周血和肺部不同時(shí)間點(diǎn)單核細(xì)胞中P35表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組外周血和肺組織中表達(dá)P35的單核細(xì)胞在2、4、8周的比例均高于相應(yīng)對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。BCG感染后第4周小鼠外周血表達(dá)P35的單核細(xì)胞明顯增加(P<0.05)，而在第8周又有所下降(P<0.05)。肺組織中表達(dá)P35的單核細(xì)胞明顯高于對(duì)照組，而實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2。

2.3EBI3在BCG感染小鼠外周血與肺組織中單核細(xì)胞內(nèi)高表達(dá) 對(duì)BCG感染小鼠外周血和肺組織中單核細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)EBI3表達(dá)情況分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組外周血和肺組織中表達(dá)EBI3的單核細(xì)胞在2、4周均高于相應(yīng)對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，小鼠感染組外周血表達(dá)EBI3的單核細(xì)胞在第4周明顯增加(P<0.05)，而第8周又顯著下降(P<0.01)，肺組織表達(dá)EBI3的單核細(xì)胞在BCG感染后第4、8周明顯增加(P<0.05)，見圖3。

圖1BCG感染后小鼠肺組織病理改變和荷菌量檢測(cè)

Fig.1AfterBCGinfectioninmicelungtissuepathologychangeandamountofbacteriadetection

Note: A.The experimental group of lung tissue sections HE staining(×20)；B.Control group lung tissue sections HE staining(×20)；C.Lung tissue sections acid-fast staining(×100)；D.Analysis of bacteria at each time point in lung tissue.***.P<0.001.

圖2不同感染時(shí)間外周血和肺組織中表達(dá)P35單核細(xì)胞的比較

Fig.2ComparisonofexpressionofP35monocytesinperipheralbloodandlungtissueatdifferenttimeofinfection

Note: A.Peripheral blood and lung tissue monocyte expression P35 flow pattern；B.P35 expression in peripheral blood mononuclear cells；C.P35 expression in lung mononuclear cells.*.P<0.05;**.P<0.01.

圖3不同感染時(shí)間外周血和肺組織中表達(dá)EBI3單核細(xì)胞的比較

Fig.3ComparisonofexpressionofEBI3monocytesinperipheralbloodandlungtissueatdifferenttimeofinfection

Note: A.Peripheral blood and lung tissue mononuclear cells expressing EBI3 flow pattern；B.EBI3 expression in peripheral blood mononuclear cells；C.Expression of EBI3 in lung tissue monocytes.*.P<0.05;**.P<0.01.

圖4不同感染時(shí)間外周血和肺組織中產(chǎn)IL-35單核細(xì)胞的比較及相關(guān)性分析

Fig.4ComparisonandcorrelationanalysisofIL-35mononuclearcellsinperipheralbloodandlungtissueatdifferenttimeofinfection

Note: A.Peripheral blood and lung tissue mononuclear cells express IL-35 flow pattern;B.IL-35 expression in peripheral blood mononuclear cells;C.IL-35 expression in lung mononuclear cells;D.P35 correlation with EBI3(n=19);E.Correlation analysis of lung IL-35 and bacteria(n=15).*.P<0.05;**.P<0.01.

2.4單核細(xì)胞IL-35在BCG感染小鼠外周血與肺組織中高表達(dá) 對(duì)BCG感染小鼠外周血和肺組織不同時(shí)間點(diǎn)單核細(xì)胞中IL-35表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組外周血和肺組織單核細(xì)胞中由P35和EBI3雙亞基組成的IL-35表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。BCG感染后小鼠外周血產(chǎn)IL-35的單核細(xì)胞在第8周明顯降低(P<0.01)，肺組織中產(chǎn)IL-35的單核細(xì)胞在第4周有顯著性增加(P<0.01)。單核細(xì)胞中P35與EBI3的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.001)，肺組織單核細(xì)胞中IL-35的表達(dá)與載菌量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見圖4。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)：①BCG感染小鼠外周血和肺組織不同周期時(shí)單核細(xì)胞中IL-35及其兩個(gè)亞基P35及EBI3表達(dá)明顯高于對(duì)照組，且在4周時(shí)增加明顯，到8周又有所下降；②感染小鼠肺組織各時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)IL-35單核細(xì)胞與荷菌量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。

單核細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞經(jīng)抗原刺激活化可生成并釋放多種細(xì)胞因子以參與機(jī)體防衛(wèi)機(jī)制，在抵御及清除病原體入侵的機(jī)體天然免疫中非常重要[17-19]。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)BCG感染小鼠外周血和肺組織單核細(xì)胞中P35 和EBI3的表達(dá)在感染后2、4、8周均較對(duì)照組有顯著增加，且實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出感染后4周顯著增加而第8周減少的趨勢(shì)，可見單核細(xì)胞中P35 和EBI3的表達(dá)在機(jī)體抵抗外來(lái)抗原刺激的免疫反應(yīng)時(shí)明顯增加。關(guān)于單核細(xì)胞中P35或EBI3單個(gè)亞基的表達(dá)在免疫性疾病中的比例變化及調(diào)節(jié)機(jī)制的研究已有報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)EBI3基因缺陷小鼠感染肝炎病毒后死亡率增高，T細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞增多使免疫應(yīng)答過(guò)激而加重炎癥反應(yīng)[20]；本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血中不僅單個(gè)核細(xì)胞高表達(dá)P35和EBI3兩個(gè)亞基的mRNA，而且P35+CD4+T細(xì)胞數(shù)與EBI3+CD4+T細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。結(jié)合上述研究推測(cè)小鼠在感染BCG后誘發(fā)宿主單核細(xì)胞表達(dá)較多的P35和EBI3可增強(qiáng)對(duì)抗MTB入侵感染機(jī)體的炎癥反應(yīng)，而P35和EBI3的增加又能提高單核細(xì)胞清除病原體能力，這或許可為研究單核細(xì)胞參與抗結(jié)核免疫應(yīng)答機(jī)制提供新的思路。

本實(shí)驗(yàn)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)P35和EBI3在單核細(xì)胞中的表達(dá)增高，且呈正相關(guān)，感染小鼠外周血單核細(xì)胞中IL-35的表達(dá)(流式細(xì)胞術(shù)分析P35和EBI3雙陽(yáng)性)在2、4周比對(duì)照組明顯升高，而實(shí)驗(yàn)組肺組織在2、4、8周較對(duì)照組增加均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示由P35和EBI3雙亞基組成的IL-35可能在單核細(xì)胞主導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著抑制病情進(jìn)展的保護(hù)性作用，小鼠外周血感染第8周時(shí)產(chǎn)IL-35的單核細(xì)胞與對(duì)照組沒(méi)有差異，可能是病程后期MTB全部定植到肺組織導(dǎo)致機(jī)體局部單核巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-35介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)。有文獻(xiàn)表明重組基因pVAX-IL-35在小鼠哮喘模型中可以產(chǎn)生長(zhǎng)效的免疫抑制，有效降低氣道的過(guò)敏性炎癥反應(yīng)[21]；IL-35還可通過(guò)減少過(guò)量的病原體細(xì)胞在靶器官聚集而有效限制疾病的發(fā)生發(fā)展[22]。另一方面，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織各時(shí)間點(diǎn)的荷菌量和單核細(xì)胞中IL-35的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)機(jī)體感染第8周時(shí)，少數(shù)毒性較強(qiáng)的MTB能逃避單核細(xì)胞的溶解吞噬作用而大量繁殖增生，單核細(xì)胞中IL-35的表達(dá)卻相應(yīng)減少，提示免疫炎癥抑制因子IL-35的增加也許對(duì)調(diào)節(jié)感染機(jī)體免疫狀態(tài)、增強(qiáng)免疫清除效果和避免病理?yè)p傷起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞在與抗原或人鼻病毒激活的DC接觸活化后，IL-35的基因水平和蛋白表達(dá)均顯著升高，且表現(xiàn)出增殖依賴性[23，24]。目前，產(chǎn)IL-35的單核細(xì)胞在結(jié)核免疫的相關(guān)研究機(jī)制還未見報(bào)道。機(jī)體在感染BCG后，單核細(xì)胞經(jīng)MTB刺激活化可分泌包括IL-35在內(nèi)的多種免疫抗炎因子以介導(dǎo)吞噬降解病原菌的抗結(jié)核炎癥反應(yīng)[25]，IL-35則可促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子分泌和影響多個(gè)T細(xì)胞亞群的分化及功能，明顯降低炎癥反應(yīng)，從而有效減緩結(jié)核病程進(jìn)一步惡化，推測(cè)產(chǎn)IL-35的單核細(xì)胞升高可能在小鼠針對(duì)結(jié)核感染疾病中具有抑制性免疫保護(hù)作用，因此，單核細(xì)胞中IL-35的表達(dá)可能對(duì)維持機(jī)體免疫平衡具有不容忽視的調(diào)控作用，有望為結(jié)核病的臨床診斷、治療和預(yù)后尋求更準(zhǔn)確有效的檢測(cè)指標(biāo)。

動(dòng)物模型遺傳背景相似，可方便有效研究人類疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律[26,27]，尾靜脈注射雖不如氣溶膠霧化的方式更能模擬人自然感染，但血液輸注較易使組織荷菌量控制在同一水平，本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)BCG感染有較強(qiáng)抵抗能力的C57小鼠[28]，小鼠肺組織抗酸染色可見MTB成功侵襲感染肺部，雖不足以引發(fā)典型結(jié)核結(jié)節(jié)出現(xiàn)，肺組織依然可見肺泡結(jié)構(gòu)紊亂和炎癥細(xì)胞聚集等病變表現(xiàn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BCG感染小鼠外周血和肺組織中產(chǎn)IL-35的單核細(xì)胞在第4周顯著增加，肺組織單核細(xì)胞內(nèi)IL-35的表達(dá)和荷菌量呈負(fù)相關(guān)，提示單核細(xì)胞表達(dá)IL-35的升高增強(qiáng)了機(jī)體抵抗MTB感染的結(jié)核免疫反應(yīng)。然而，產(chǎn)IL-35的單核細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用機(jī)制以及IL-35在人與鼠體內(nèi)表達(dá)方式的差異還有待我們進(jìn)一步研究探討和深入了解。

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