林才厚， 陳建屏， 王春華， 鄭水順， 祁小龍， 石松生

惡性膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)被認為是惡性膠質(zhì)瘤高死亡率和致殘率的重要原因[1]。盡管膠質(zhì)瘤的綜合治療手段不斷提高，但大部分高級別膠質(zhì)瘤的無進展生存期(progression free survival, PFS)均未超過7月，而幾乎所有膠質(zhì)瘤患者36月內(nèi)都會有病情進展[2]。因此，研究惡性膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的機制及與PFS的關(guān)系成了膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的新熱點。

膠質(zhì)瘤上皮間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)及膠質(zhì)瘤干細胞對治療的耐受被認為是目前惡性膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的重要原因[3-4]。ZEB1是膠質(zhì)瘤EMT進程的重要啟動分子，Nestin則是目前公認的膠質(zhì)瘤干細胞標記物[5]。既往的研究大多集中于ZEB1及Nestin在膠質(zhì)瘤上的表達及與預(yù)后的關(guān)系[5-8],而對于膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)前后ZEB1及Nestin表達變化的研究甚少，特別是高級別膠質(zhì)瘤ZEB1或Nestin表達與PFS的關(guān)系更是鮮有報道。本研究采用免疫組織化學(xué)法和圖像分析技術(shù)對39例高級別膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)前后石蠟標本中的ZEB1及Nestin進行檢測，探討這2個指標與患者PFS的相關(guān)性，及其在膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1對象 收集2008年1月-2013年1月于筆者單位接受手術(shù)治療及規(guī)范放化療的高級別膠質(zhì)瘤患者39例，男性19例，女性20例，年齡(50.08±9.38)歲(35～71歲)。納入標準：(1)患者均為原發(fā)膠質(zhì)瘤，且初次行膠質(zhì)瘤全切術(shù)，術(shù)后行規(guī)范化放療及替莫唑胺化療，由同一醫(yī)院定期隨訪，第2次手術(shù)仍在同一醫(yī)院進行；(2)無其他惡性腫瘤、全身系統(tǒng)性疾病及免疫性疾??；(3)有完整規(guī)范的術(shù)后病理報告、影像學(xué)資料及隨訪報告；(4)KPS>70分。排除標準：(1)患者非正常死亡；(2)隨訪中斷患者。取患者初次及第2次手術(shù)的石蠟標本進行研究。

另收集同期就診的因顱腦外傷行腦減壓術(shù)的患者10例，男性6例，女性4例，年齡(39.7±12.69)歲(25～72歲)。納入標準：術(shù)前身體健康，無其他惡性腫瘤、全身系統(tǒng)性疾病及免疫性疾病，頭顱CT檢查排除腦腫瘤性病變。取正常腦組織石蠟標本作為對照。對所有納入研究的患者進行為期60月的隨訪，以患者死亡作為終點事件。所有研究事項均與患者及家屬簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1材料 ZEB1兔多克隆抗體(貨號：HPA027524，美國Sigma公司)；Nestin兔單克隆抗體(貨號：ab105389，英國Abcam公司)。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色 操作嚴格按說明書進行。石蠟切片經(jīng)烤片及脫蠟水化后，用枸櫞酸鹽緩沖液高壓抗原修復(fù)，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化酶，正常羊血清封閉，洗凈后孵育一抗，4 ℃過夜。加二抗室溫孵育20 min，經(jīng)DAB顯色和蘇木精復(fù)染后，脫水封片。

1.2.3免疫組織化學(xué)評分標準 由2名病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片，ZEB1及Nestin陽性染色鏡下呈棕黃色或棕褐色，在高倍鏡(×400)下隨機選擇5個視野，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析處理軟件計算ZEB1及Nestin陽性細胞的平均光密度，代表ZEB1及Nestin的表達水平，并根據(jù)平均光密度的中位數(shù)將患者分為高表達組和低表達組[9]。

1.3隨訪 通過查閱病歷資料采集患者的臨床基本信息，包括影像學(xué)資料，并制定隨訪表，主要采用電話和門診隨訪2種方式。影像學(xué)中壞死、衛(wèi)星灶、囊變及腫瘤大小的區(qū)分參照文獻[10]，并由2位神經(jīng)外科醫(yī)師和2位神經(jīng)影像學(xué)醫(yī)師共同判斷結(jié)果。PFS定義為：患者第一次規(guī)范治療后至臨床隨訪判斷腫瘤再次進展或者影像學(xué)檢測提示腫瘤復(fù)發(fā)。

2 結(jié) 果

2.1ZEB1及Nestin在高級別膠質(zhì)瘤上復(fù)發(fā)前后的表達 ZEB1在正常腦組織和復(fù)發(fā)前后的惡性膠質(zhì)瘤腦組織中均有不同程度表達，主要表達于細胞膜和細胞核上(圖1)。膠質(zhì)瘤腦組織的ZEB1表達，復(fù)發(fā)前比正常腦組織明顯增高[(0.609±0.133)vs(0.426±0.026 1),P<0.01]，復(fù)發(fā)后也較復(fù)發(fā)前明顯增高[(0.703±0.176)vs(0.609±0.133),P<0.01]。Nestin在復(fù)發(fā)前后的惡性膠質(zhì)瘤腦組織中呈不同程度表達，主要表達于細胞質(zhì)中(圖1)。膠質(zhì)瘤腦組織的Nestin表達，復(fù)發(fā)后較復(fù)發(fā)前明顯增高[(0.375±0.096 6)vs(0.333±0.071 0)，P=0.014]。

A～C：ZEB1在正常腦組織和同一例高級別膠質(zhì)瘤患者復(fù)發(fā)前后的表達，復(fù)發(fā)后ZEB1表達明顯高于復(fù)發(fā)前和正常腦組織；D～E：Nestin在同一例高級別膠質(zhì)瘤患者復(fù)發(fā)前后的表達，復(fù)發(fā)后表達明顯高于復(fù)發(fā)前.圖1 ZEB1和Nestin在高級別膠質(zhì)瘤中的表達(H-E染色 ×400)Fig 1 Expression of ZEB1 and Nestin in high grade gliomas(H-E staining ×400)

2.2高級別膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)前ZEB1及Nestin表達與PFS的關(guān)系 根據(jù)復(fù)發(fā)前ZEB1及Nestin表達的平均光密度的中位數(shù)(0.643及0.337)將高級別膠質(zhì)瘤分為高表達組和低表達組。單因素分析顯示，ZEB1與Nestin與高級別膠質(zhì)瘤的PFS有關(guān)(圖2，表1)。Spearman法分析顯示，隨著Nestin表達增高，ZEB1表達明顯增高。相關(guān)性分析顯示，高級別膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)前ZEB1的表達與Nestin的表達存在顯著正相關(guān)(rs=0.670,P<0.001)。

PFS：無進展生存期. A：ZEB1低表達組較高表達組PFS長，經(jīng)Log-rank檢驗，P<0.001； B：Nestin低表達組較高表達組PFS長，經(jīng)Log-rank檢驗，P=0.004； C：Spearman法分析顯示，ZEB1表達與Nestin表達呈正相關(guān)(rs=0.670,P<0.001).圖2 ZEB1及Nestin表達與PFS的關(guān)系及ZEB1表達與Nestin表達的相關(guān)性Fig 2 The relationship of ZEB1, Nestin expression with PFS, and the correlation between ZEB1 expression and Nestin expression

表1 影響高級別膠質(zhì)瘤PFS的臨床指標的單因素分析

PFS：無進展生存期.

2.3高級別膠質(zhì)瘤患者PFS影響因素的單因素和多因素分析 單因素分析顯示，年齡(50歲為界)、衛(wèi)星灶、壞死、ZEB1表達及Nestin表達與規(guī)范化治療后高級別膠質(zhì)瘤的PFS有相關(guān)性(表1)，而性別、病理分級、囊變及腫瘤大小(4 cm為界)與高級別膠質(zhì)瘤的PFS無明顯相關(guān)。使用Cox比例風(fēng)險模型，采用逐步回歸分析法，將單因素分析有意義的5種因素，包括年齡、衛(wèi)星灶、壞死、ZEB1表達及Nestin表達進行多因素分析，結(jié)果顯示，ZEB1表達為影響腫瘤PFS的獨立因素(95%CI：3.016～19.194，P<0.001)。

3 討 論

體外研究表明，高級別膠質(zhì)瘤中因膠質(zhì)瘤干細胞對治療的抵抗導(dǎo)致其復(fù)發(fā)是其預(yù)后差的根本原因[11]，而有關(guān)體內(nèi)膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)與初治標本中膠質(zhì)瘤干細胞表達差別的研究甚少。Nestin是經(jīng)典的膠質(zhì)瘤干細胞標記物[12]。本研究中，相較于初治標本，復(fù)發(fā)標本的Nestin較高，這意味著復(fù)發(fā)高級別膠質(zhì)瘤中，膠質(zhì)瘤干細胞比例增加。膠質(zhì)瘤干細胞被認為是高級別膠質(zhì)瘤治療抵抗的根本原因[13]，這從某種程度上解釋了復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為更加惡性、對治療的反應(yīng)性明顯降低的原因，與體外實驗的研究結(jié)果基本一致。復(fù)發(fā)后的高級別膠質(zhì)瘤不僅對治療耐藥，而且更具有侵襲性。越來越多研究表明，EMT進程的關(guān)鍵分子ZEB1參與了高級別膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)侵襲過程[14]。本研究中，復(fù)發(fā)標本ZEB1表達較初治標本高，意味著復(fù)發(fā)后的膠質(zhì)瘤更具有侵襲性，這與臨床上復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤更具有侵襲性、惡性度更高一致[1,15]。更為有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)，ZEB1表達與Nestin表達呈正相關(guān)，說明高級別膠質(zhì)瘤在復(fù)發(fā)的過程中，膠質(zhì)瘤干細胞不僅比例增高，而且很可能也參與了高級別膠質(zhì)瘤的EMT進程，與最新的研究成果基本一致[16]。

腫瘤的PFS被認為可在短時間及持續(xù)時間內(nèi)反映腫瘤治療過程中疾病的進展情況，對評價治療策略具有重要的臨床意義[17]。本研究經(jīng)單因素分析顯示，Nestin表達、年齡、衛(wèi)星灶及壞死與高級別膠質(zhì)瘤中PFS有關(guān)，與既往研究基本一致[12,18-20]。多因素分析顯示，ZEB1表達是影響高級別膠質(zhì)瘤PFS的獨立因素，而年齡、衛(wèi)星灶、壞死及Nestin表達并不是獨立因素。這與有的研究不一樣，歸結(jié)于跟病例選擇有關(guān)。本研究選擇的是配對病例，且KPS>70分，患者均經(jīng)過手術(shù)全切及規(guī)范化的放化療，可能對結(jié)果產(chǎn)生一定影響?？梢娔z質(zhì)瘤細胞的EMT對腫瘤的復(fù)發(fā)和侵襲具有重要作用，對臨床認識高級別膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)進程具有一定的意義。

綜上分析，ZEB1在腫瘤復(fù)發(fā)標本中的表達較初治標本明顯升高，而且是影響高級別膠質(zhì)瘤PFS的獨立因素，ZEB1可能是未來預(yù)防高級別膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的一個重要分子。本研究也存在一些不足之處，本研究只停留在免疫組織化學(xué)水平，尚缺乏在細胞、動物及分子水平的研究，且標本量偏小。未來的研究應(yīng)擴充樣本量，并開展多水平如細胞、動物和分子水平的研究，以充分驗證該研究結(jié)果。