林 晨， 許貽文， 柯 方,2， 陳曉樂,2， 許建華,2， 林 媚

吡咯并[1,2-a]喹喔啉衍生物是一類具有極高應(yīng)用前景的含氮稠雜環(huán)化合物，一些高度選擇性的環(huán)核苷酸碳酸二酯酶(cyclic nucleotide phosphodiesterase，PDE)同功酶抑制劑和NF-κB中的IκB激活酶抑制劑就含有咪唑并喹喔啉結(jié)構(gòu)[1]。因其具有抗腫瘤、抗病毒和抗?jié)兊葟V泛高效的生理、藥理活性，具有較好的應(yīng)用前景，越來越受研究者們重視，已逐漸成為藥學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點[2-4]。咪唑并喹喔啉的傳統(tǒng)制備方法以2-氯喹喔啉和鄰氟硝基苯為原料，經(jīng)過親核取代反應(yīng)、硝基還原和環(huán)合過程制得產(chǎn)物[5-6]。2014年，Huang等采用銅鹽催化獲得了咪唑并[1,2-a]喹喔啉[7]。目前合成咪唑并[1,2-a]喹喔啉的方法受到很大限制，如操作繁瑣、條件苛刻和底物難以制備等缺點。因此，發(fā)展相對高效、廉價的合成咪唑并[1,2-a]喹喔啉先導(dǎo)化合物的方法成為熱點。

乳腺癌是一種女性常見惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[8]。在所有乳腺癌患者中，人表皮生長因子受體2(human epidermal grouth factor receptor 2,HER2)陽性乳腺癌占20%～30%[9]。HER2是臨床監(jiān)測乳腺癌預(yù)后的重要指標之一，也是設(shè)計腫瘤靶向治療藥物的重要靶點。人類不斷研究探索更加高效低毒的新藥物，期待它對HER2陽性細胞具有高效殺傷作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，喹喔啉衍生物可對乳腺癌細胞具有較好的抑制作用[10]。

本研究探討在微波輻射下，采用NiCl2和1,10-菲啰啉(1,10-phen)作為催化劑，通過2-氯甲基苯并咪唑和N-4-甲苯磺酰基-2-氨基碘苯為底物制備具有潛在抗腫瘤活性的咪唑并[1,2-a]喹喔啉衍生物的方法(合成線路如圖1所示)，研究其對HER2陰性和HER2陽性乳腺癌細胞的殺傷能力，為進一步篩選具有高抗腫瘤活性的喹喔啉做前期研究。

圖1 咪唑并[1,2-a]喹喔啉化合物的合成

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 2-氯甲基苯并咪唑和N-4-甲苯磺酰基-2-氨基碘苯及其衍生物均為美國Sigma-aldrich公司分析純。其余試劑均為市售化學(xué)純產(chǎn)品，未經(jīng)進一步純化；腫瘤細胞株 MCF-7和SKBR3細胞由福建醫(yī)科大學(xué)新藥研究所傳代培養(yǎng)。

1.1.2儀器 微波合成儀(Initiator+，瑞典Biotage公司)；高效液相色譜-質(zhì)譜儀(LCMS-2020，日本島津公司)；核磁共振儀(AM-80，德國Bruker Biospin公司)；1H NMR：400MHz (溶劑： CDCl3),13CNMR: 100 MHz (溶劑：CDCl3)；全自動酶標儀(680型，美國BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1咪唑并[1,2-a]喹喔啉的合成方法 將1.2 mmol 2-氯甲基苯并咪唑和1 mmolN-4-甲苯磺酰基-2-氨基碘苯加入到干燥的10 mL長頸燒瓶中，依次加入0.1 mmol NiCl2，0.1 mmol 1,10-phen，3.0 mmol NaOH，再加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶劑3 mL。微波反應(yīng)器設(shè)定120 W功率并加熱至110 ℃反應(yīng)30 min。停止反應(yīng)后冷卻至室溫，減壓濃縮，對所得粗產(chǎn)品進行柱層析得目標產(chǎn)物，計算產(chǎn)率。

1.2.2細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞MCF-7和SKBR3細胞采用含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基、青霉素(1×105IU/L)和鏈霉素(50 mg/L)在37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2孵育箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.3細胞劃痕實驗 采用細胞劃痕實驗測試對應(yīng)化合物a～e對人乳腺癌細胞MCF-7的生長和遷移活性，具體步驟如下：收集MCF-7對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞濃度，接種12孔板，每孔細胞數(shù)1×105個；種板后12 h，MCF-7完全貼壁，采用移液槍槍頭在細胞上劃“一”字，PBS洗滌3次，去除劃痕下的MCF-7細胞；加入含待測藥的2%血清的培養(yǎng)基(2% FBS，1%青霉素和鏈霉素混合液的DMEM)，待測藥終濃度設(shè)置為20.0,40.0,60.0,80.0 μmol/L；放入37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取樣，檢測化合物對MCF-7遷移活性的抑制。

1.2.4MTT實驗 為進一步探討此衍生物的抗腫瘤活性，采用MTT法測試化合物a～e對MCF-7和SKBR3的增殖抑制活性。具體步驟如下：收集對數(shù)期生長的MCF-7及SKBR3細胞，調(diào)整細胞懸液濃度約為5×104mL-1，接種于96孔板，每孔加入500 μL；37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱孵育至細胞單層鋪滿孔底，并設(shè)置對照組(未添加化合物)、空白組(只加培養(yǎng)基)，每組設(shè)3個復(fù)孔，待測藥終濃度分別為5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 μmol/L；并在37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；停止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，至搖床上低速震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。采用全自動酶標儀檢測570 nm處的吸光度(OD)值。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 結(jié)果采用GraphPad Prism 5 軟件分析，計算藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。組間比較采用One Way Anova進行檢驗分析。

2 結(jié) 果

2.1產(chǎn)物與產(chǎn)率 在微波輔助條件下，通過高效且便宜的鎳催化體系快速制備了咪唑并[1,2-a]喹喔啉衍生物，反應(yīng)速度較常規(guī)加熱條件下明顯加快，提高了合成反應(yīng)的產(chǎn)率和效率，具有操作簡單、條件溫和的優(yōu)點。在最優(yōu)反應(yīng)條件下，選取一系列2-氯甲基苯并咪唑和N-4-甲苯磺酰基-2-氨基碘苯衍生物進行反應(yīng)，上述催化體系對各種取代的N-對甲苯磺?；?2-碘苯胺和2-氯甲基苯并咪唑均具有較高的催化活性，含各種供電基團和吸電基團的2-氯甲基苯并咪唑和N-4-甲苯磺?；?2-氨基碘苯衍生物均能較好反應(yīng)生成相應(yīng)的咪唑并[1,2-a]喹喔啉，取代基的電子效應(yīng)對反應(yīng)有影響，供電子取代基的活性略大于吸電子取代基化合物(圖2)。

圖2 咪唑并[1,2-a]喹喔啉化合物的合成Fig 2 Synthesis of quinoxaline compounds

2.2結(jié)果表征數(shù)據(jù) 化合物結(jié)構(gòu)鑒定與文獻[11]相比，核磁和質(zhì)譜數(shù)據(jù)基本一致。

苯并咪唑[1,2-a]喹喔啉(a)：白色固體，m. p. 179～180 ℃，產(chǎn)率88%；1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.32 (s，1H), 8.54(dd,J= 8.0 Hz, 1.0 Hz, 1H), 8.42 (m, 1H)，8.24 (dd,J= 8.0, 1.4 Hz, 1H), 8.13～8.21 (m, 1H)，7.77～7.84 (m, 1H), 7.61～7.81 (m，3H);13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 114.4,115.0,122.1,125.0,125.9,125.8,129.9,130.1,131.2,135.9,141.1,144.2,146.0;MS (EI,m/z):220[M+]。

2-甲基苯并咪唑[1,2-a]喹喔啉(b)：白色固體，m.p. 167～168 ℃，產(chǎn)率90%；1H NMR(400 MHz,CDCl3):δ 9.21(s,1H),8.38～8.42(m,1H),8.27(s,1H),8.10～8.16(m,1H),8.06(d,J=8.0 Hz,1H),7.59～7.66(m,2H),7.42(dd,J=8.0 Hz，1.2 Hz,1H),2.69(s,3H);13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ 22.6,115.4,114.6,122.6,124.6,125.5,126.9,129.6,130.2,131.9,133.9,140.8,141.4,144.0,145.0;MS(EI,m/z):234[M+]。

2-氯苯并咪唑[1,2-a]喹喔啉(c)：白色固體，m. p. 177～178 ℃，產(chǎn)率 80%；1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.27 (s, 1H), 8.49 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.36～8.40 (m，1H)，8.13～8.19 (m, 2H), 7.60 (dd,J= 8.6, 2.1 Hz，IH);13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 114.1, 115.0,122.3, 125.3, 126.0, 126.1, 129.8, 130.2, 132.2, 134.3, 135.8, 140.9, 144.3, 146.2; MS (EI, m/z): 254 [M+]。

9-甲基苯并咪唑[1,2-a]喹喔啉(d)：白色固體，m. p. 171～172 ℃，產(chǎn)率 87%；1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.25 (q,J= 1.6 Hz，2H), 8.50 (t,J= 9Hz, 2H), 8.30 (d,J= 8.6 Hz, 1H), 8.20 (d，J= 7.8 Hz, 3H)，8.03 (d，J= 8.4 Hz, IH),7.92 (s, 1H), 7.78 (m, 2H), 7.62 (t,J= 8.0 Hz, 2H), 7.47 (t,J= 7.6 Hz, 2H), 2.70 (s, 2.4H), 2.63 (s，3.6H);13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 21.6, 22.4, 113.9，114.1，114.8, 114.8，121.5, 121.7, 125.5, 126.5, 127.9, 128.3, 129.7, 129.9，131.1，135.4，135.7，135.9, 135.9, 141.0，141.4, 142.7, 144.8，146.1，146.2; MS (EI, m/z): 234 [M+]。

9-氯苯并咪唑[1,2-a]喹喔啉(e)：黃色固體，m. p. 174～176 ℃，產(chǎn)率85%；1H NMR(400 MHz,CDCl3): δ 9.28 (d,J= 3.2 Hz, 1H), 8.33～8.46 (m, 2H), 8.24 (dd,J= 7.8, 1.2 Hz, IH), 8.66～8.13(m, 1H), 7.79～7.86 (m, IH), 7.55～7.69 (m, 2H);13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 114.4, 114.9, 115.1, 121.7, 122.8, 124.3, 125.6, 126.4, 126.5, 126.8, 128.4, 128.9, 130.7, 130.7, 131.4, 131.5, 131.7, 136.9, 138.8, 142.1, 145.2, 145.9, 146.4; MS (EI, m/z): 254 [M+]。

2.3對細胞遷移活性的抑制 咪唑[1, 2-a]喹喔啉結(jié)構(gòu)中當(dāng)苯環(huán)上不含取代基a或者喹喔啉環(huán)上含甲基b時，對MCF-7細胞具有的抑制作用不強(c>40 μmol/L)；當(dāng)化合物喹喔啉環(huán)2位上是引入取代的Cl原子c時，對MCF-7的抑制濃度達到20 μmol/L；而當(dāng)喹喔啉環(huán)9位上取代是Cl原子e時，抑制細胞生長濃度均>20 μmol/L。由此可見, 咪唑[1, 2-a]喹喔啉結(jié)構(gòu)中含有吸電子的Cl時, 化合物針對抑制MCF-7細胞生長具有較高活性，最低抑制濃度為20 μmol/L，細胞毒活性明顯增大。

表1 咪唑并[1,2-a]喹喔啉對 MCF-7細胞遷移活性的抑制

2.4化合物對乳腺癌細胞MCF-7和SKBR3增殖的抑制作用 MCF-7和 HER2陽性的SKBR3細胞經(jīng)不同濃度的新化合物處理48 h后，MTT法檢測咪唑[1,2-a]喹喔啉化合物對乳腺癌不同種類細胞的增殖和抑制作用。結(jié)果表明：隨著藥物濃度的增加，喹喔啉化合物抑制MCF-7和SKBR3細胞增殖的能力逐步增強，針對MCF-7和SKBR3的半數(shù)抑制濃度IC50見表2。其中化合物c和e具有較強的抑制乳腺癌細胞增殖的作用，IC50均在12～18 μmol/L，經(jīng)過對比實驗，該類化合物的半抑制率濃度略差于紫杉醇活性，具備進一步通過結(jié)構(gòu)改造，篩選出具備高抗腫瘤活性的喹唑啉化合物的潛力，并為進一步進行抗腫瘤活性的體內(nèi)研究提供潛在藥物分子。

2.5統(tǒng)計結(jié)果 經(jīng)過One Way ANOWA分析統(tǒng)計，在MCF-7細胞組中，化合物c和e分別與化合物a的IC50比較，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 咪唑[1,2-a]喹喔啉對乳腺癌細胞的抑制作用

IC50：半數(shù)抑制濃度.

3 討 論

通過微波輻射法，采用鎳催化劑高效合成了5個咪唑并[1,2-a]喹喔啉衍生物。含吸電子基團的化合物其細胞毒活性明顯大于含供電子基團的化合物，尤其含Cl原子取代的化合物。在針對MCF-7和SKBR3腫瘤細胞抑制作用實驗中，2-氯苯并咪唑[1,2-a]喹喔啉(c)和9-氯苯并咪唑[1,2-a]喹喔啉(e)也對MCF-7和SKBR3腫瘤細胞增殖抑制活性好。含有Cl原子的苯并咪唑[1,2-a]喹喔啉活性相對其他化合物強，與其他化合物相比均有顯著差異性(P<0.05)。由此可見，含有Cl原子的苯并咪唑[1,2-a]喹喔啉是具有高度活性的先導(dǎo)化合物，可進一步通過構(gòu)效關(guān)系對其進行結(jié)構(gòu)改造和靶點優(yōu)化，篩選出活性更好的新型抗腫瘤藥物。