黃 穎，張翠云

(福建師范大學(xué) 化學(xué)與材料學(xué)院，福建 福州 350007)

瘦肉精屬于β2-受體激動劑類藥物，沙丁胺醇作為瘦肉精的一種，被廣泛地應(yīng)用于哮喘病治療[1-2]。另一方面，在動物飼料中加入β2-受體激動劑，可促進(jìn)糖元分解[3-4]，加速蛋白轉(zhuǎn)化[5]，能有效提高酮體瘦肉率，長期食用含有β2-受體激動劑的瘦肉，會導(dǎo)致染色體變異甚至威脅到生命安全[6-7]。因此，迫切需要建立可以靈敏檢測β2-受體激動劑的分析方法。

到目前為止，色譜[6-9]、酶聯(lián)免疫[10]、毛細(xì)管電泳[11-12]、納米均相時間分辨熒光免疫[13]、電化學(xué)[14-15]及電化學(xué)免疫傳感[16-18]等方法已用于瘦肉精分析。其中，電化學(xué)免疫傳感器由于便捷、省時、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點，受到人們的關(guān)注。

本文構(gòu)建了新型的免標(biāo)型免疫傳感器檢測沙丁胺醇。以茜素作為氧化還原探針，二氧化鈦、乙炔黑和殼聚糖的復(fù)合材料作為信號放大平臺,利用金納米粒子固定抗體和對信號進(jìn)行進(jìn)一步放大。利用抗原抗體發(fā)生免疫親和反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物，使茜素峰電流發(fā)生變化以實現(xiàn)對目標(biāo)分析物的檢測。該免疫傳感器已用于實際樣品的分析，取得了滿意結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

沙丁胺醇抗原、抗體購自深圳華英生物技術(shù)有限公司。氯金酸(HAuCl4)、牛血清蛋白(BSA)購于北京百靈威科技有限公司。沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。茜素(AR)購于上海麥克林生化科技有限公司。二氧化鈦(TiO2)購于上海試一化學(xué)試劑有限公司。乙炔黑(純度>99%)購于美國Strem 化學(xué)品有限公司。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。不同pH值的緩沖溶液由0.1 mol/L的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配制而成。所有試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 設(shè) 備

循環(huán)伏安法(CV)、電化學(xué)阻抗(EIS)和差分脈沖伏安法(DPV)均在電化學(xué)工作站CHI660D(上海辰華儀器公司)上完成。使用裸玻碳電極或修飾玻碳電極為工作電極，飽和Ag/AgCl 為參比電極，鉑電極為對電極的三電極系統(tǒng)。

1.3 AR-TiO2-AB-CS 復(fù)合材料的制備

將一定比例的乙炔黑和二氧化鈦置于1 g/L的殼聚糖乙酸溶液中超聲30 min，然后與0.01 mol/L茜素溶液按照體積比為2∶1進(jìn)行混合并繼續(xù)超聲30 min，置于4 ℃冰箱中保存。

1.4 修飾電極的制備

玻碳電極以0.3～0.05 μm的氧化鋁粉分別打磨3 min，用乙醇和水依次超聲清洗2 min后晾干待用。取5 μL AR-TiO2-AB-CS復(fù)合材料滴涂于電極表面，于室溫下風(fēng)干。將制得的電極置于1 mmol/L HAuCl4的H2SO4溶液中,于-0.2 V下采用計時電流法在電極表面電沉積金納米粒子300 s，用蒸餾水清洗晾干后，取5 μL anti-SAL (100 mg/L)滴涂在修飾電極表面于35 ℃下反應(yīng)1 h完成抗體的固定，用pH 7.0的PBS和水依次清洗后晾干。最后在1%的BSA溶液中，于35 ℃下反應(yīng)1 h以封閉多余的活性位點。清洗晾干后，得到BSA/anti-SAL/AuNPs/AR-TiO2-AB-CS/GCE，并于4 ℃保存。將不同濃度的SAL于BSA/anti-SAL/AuNPs/AR-TiO2-AB-CS/GCE表面反應(yīng)40 min，進(jìn)行電化學(xué)檢測。免疫傳感器制備過程示意圖見圖1。

圖1 免疫傳感器制備過程示意圖Fig.1 The preparation process of immunosensor

1.5 實際樣品的處理過程

豬飼料和豬肉分別購于福建湘大駱駝飼料有限公司和福州永輝超市。參照文獻(xiàn)[17-18〗制備豬飼料和豬肉樣品的提取液，具體制備過程如下：稱取5 g豬飼料，加入50 mL磷酸-甲醇萃取液，磁力攪拌30 min后，3 200 r/min下離心10 min，上清液于55 ℃水浴中濃縮至近干，用1 mL pH 7.0的PBS緩沖溶液充分溶解，4 ℃保存，待分析。另稱取10 g瘦肉，剁碎后加入20 mL 0.1 mol/L HClO4，超聲20 min后于80 ℃水浴中加熱30 min，冷卻后離心15 min，取上清液，剩余沉淀物用5 mL 0.1 mol/L HClO4再次洗滌離心，合并上清液，用NaOH調(diào)至pH 10.0后離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)至玻璃管中，加入8 g NaCl和25 mL 異丙醇-乙酸乙酯混合溶劑(V異丙醇∶V乙酸乙酯=2∶3)，振蕩提取20 min，離心分離，移取上層有機相于60 ℃水浴中濃縮至近干，用1 mL pH 7.0的PBS緩沖溶液充分溶解，4 ℃保存，待分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 AR-TiO2-AB-CS 復(fù)合材料的表征

本文成功制備了AR-TiO2-AB-CS復(fù)合材料，并利用SEM對復(fù)合材料進(jìn)行表征。從圖2A可以看出，乙炔黑表面光滑，呈細(xì)條狀，出現(xiàn)少量團聚現(xiàn)象。從圖2B可以看出，二氧化鈦顆粒較均勻，尺寸為納米級別。如圖2C所示，向乙炔黑中加入納米二氧化鈦后，二氧化鈦嵌入乙炔黑中，有效地避免乙炔黑的團聚作用，增加了復(fù)合材料的表面積，提高了復(fù)合材料的導(dǎo)電性。

圖3 不同修飾電極在PBS緩沖溶液(pH 7.0)中的循環(huán)伏安曲線 Fig.3 CV curves of different modified electrodes in pH 7.0 PBSa.bare GCE,b.AR-AB-CS/GCE,c.AR-TiO2-AB-CS/GCE,d.AuNPs/AR-TiO2-AB-CS/GCE,e.anti-SAL/AuNPs/AR-TiO2-AB-CS/GCE,f.BSA/anti-SAL/AuNPs/AR-TiO2-AB-CS/GCE；scan rate：100 mV/s

2.2 修飾電極的電化學(xué)行為

本文利用循環(huán)伏安法(CV)，在pH 7.0的緩沖溶液中，對所構(gòu)建的免疫傳感器制備過程進(jìn)行表征。從圖3可以看出，裸玻碳電極(曲線a)未出現(xiàn)相應(yīng)的氧化還原峰。當(dāng)在電極表面修飾上AR-AB-CS 復(fù)合材料時(曲線b)，出現(xiàn)1對可逆性良好的氧化還原峰，且峰電流值較高，這歸功于茜素的良好電化學(xué)活性以及乙炔黑的良好導(dǎo)電性[19]。當(dāng)AR-TiO2-AB-CS 復(fù)合材料修飾于電極表面后(曲線c)，氧化峰電流增大，說明納米金屬氧化物與碳復(fù)合材料可有效地提高電子轉(zhuǎn)移速率[20]。在修飾電極表面進(jìn)一步電沉積納米金時(曲線d)，由于金納米的良好導(dǎo)電性，峰電流進(jìn)一步增大。當(dāng)在修飾電極表面固定anti-SAL后(曲線e)，峰電流明顯降低，表明抗體已成功固定在修飾電極表面。使用1% BSA封閉多余的活性位點(曲線f)后，峰電流進(jìn)一步降低。這是因為anti-SAL和BSA均為生物大分子，導(dǎo)電能力較差，阻礙了電子在電極表面的傳遞過程。

圖4 在1 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-(500 mmol/L KCl)中不同修飾電極的電化學(xué)阻抗曲線Fig.4 EIS curves of different modified electrodes performed in the solution of 1 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-containing 500 mmol/L KCl a.bare GCE,b.AR-AB -CS/GCE,c.AR-TiO2-AB-CS/GCE,d.AuNPs/AR-TiO2-AB-CS/GCE,e.anti-SAL/AuNPs/AR-TiO2-AB-CS/GCE,f.BSA/anti-SAL/AuNPs/AR-TiO2-AB-CS/GCE；scan rate：100 mV/s

圖5 修飾電極在pH 7.0 PBS中的循環(huán)伏安特性曲線Fig.5 CV curves of BSA/anti-SAL/AuNPs/AR-TiO2-AB-CS/GCE in pH 7.0 PBSscan rates(a to i): 10,30,50,70,90,100,110,120,130 mV/s;insert: linear relation of peak currents (I) to scan rates(v)and square root of scan rates(v1/2)

進(jìn)一步用電化學(xué)交流阻抗譜(EIS)表征不同修飾電極的阻抗變化情況(圖4)。結(jié)果顯示，相比于裸玻碳電極(曲線a)，乙炔黑的良好導(dǎo)電能力使得AR-AB-CS修飾電極的阻抗值明顯減小(曲線b)。加入二氧化鈦后，二氧化鈦和乙炔黑發(fā)生協(xié)同作用，使得AR-TiO2- AB-CS修飾電極的阻抗值進(jìn)一步減小(曲線c)。在AR-TiO2-AB-CS表面進(jìn)一步電沉積金納米粒子后(曲線d)，阻抗值進(jìn)一步減小，表明金納米粒子可以促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移。當(dāng)沙丁胺醇抗體和牛血清蛋白依次固定在電極表面后(曲線e,f)，由于蛋白質(zhì)會阻礙電子轉(zhuǎn)移，使得阻抗值依次增大。以上實驗結(jié)果表明免疫傳感器已成功制備。

圖5為不同掃描速率對修飾電極的影響。在pH 7.0 PBS中，當(dāng)掃描速率在10 ～130 mV/s范圍變化時，氧化峰電流與掃速的平方根呈線性關(guān)系，線性回歸方程為I=13.163v1/2-12.11 (r2=0.999 2)，表明修飾電極的化學(xué)行為受擴散控制。

2.3 免疫條件的優(yōu)化

首先研究了背景電解質(zhì)的pH值對電流信號的影響，結(jié)果顯示，隨著pH值的增大，電流呈先增大后減小的趨勢，在pH 7.0時，獲得最高的電流值，因此本實驗選用pH 7.0的緩沖溶液。隨后研究了孵化溫度的影響，發(fā)現(xiàn)電流信號隨著溫度的增加呈先增加后降低的趨勢，在35 ℃下得到最佳的電流響應(yīng)，故選擇該免疫傳感器的適宜孵化溫度為35 ℃。最后研究了孵化時間對免疫親和反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)電流響應(yīng)隨著時間的延長呈減少的趨勢，并于40 min后趨向穩(wěn)定，所以選擇40 min作為抗原抗體孵化的時間。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過差分脈沖伏安法檢測一系列不同濃度的沙丁胺醇。在最佳條件下，隨著沙丁胺醇濃度的增大，電流信號逐漸減小。電流信號與SAL濃度的線性回歸方程為：I=-0.757 6c+97.12(1.0～10 μg/L,r2=0.993 6)和I=-0.190 3c+92.52(10～100 μg/L,r2=0.990 6)，檢出限(LOD)為0.67 μg/L(3σ/k)。如表1所示，本文所構(gòu)建的免疫傳感器與已報道的沙丁胺醇檢測方法相比，具有較低的檢出限。

表1 沙丁胺醇檢測方法的對比Table 1 Comparison of methods for detecting salbutamol

2.5 免疫傳感器的重現(xiàn)性、選擇性與穩(wěn)定性

使用6支不同的工作電極測定10 μg/L沙丁胺醇，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.4%；使用同一工作電極連續(xù)測定6組，RSD為0.7%，說明該免疫傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

為研究該免疫傳感器的選擇性，以克倫特羅、維生素C、葡萄糖作為干擾性物質(zhì)進(jìn)行實驗。結(jié)果顯示，分別加入10、100、1 000 μg/L上述物質(zhì)后，電流值的RSD均小于5%，表明該免疫傳感器具有良好的選擇性。

為研究該免疫傳感器的穩(wěn)定性，將該免疫傳感器放置于冰箱中4 ℃保存。15 d后，電流值減小至初始電流的95.98%，1個月后，電流值為初始電流的93.83%，說明該免疫傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

2.6 實際樣品檢測

將上述所建立的方法用于實際樣品分析，分別于飼料和豬肉中加入不同濃度的SAL標(biāo)準(zhǔn)溶液，其加標(biāo)回收率分別為100.2%～102.4%(RSD為1.9%～4.7%)和97.5%～103.3%(RSD為2.1%～3.5%)，結(jié)果如表2所示，表明該免疫傳感器可用于實際樣品檢測。

表2 飼料和豬肉中SAL的加標(biāo)回收實驗(n=3)Table 2 The standard addition recovery experiments of SAL in swine feed and pork samples(n=3)

3 結(jié) 論

本文構(gòu)建了一種新型免標(biāo)型免疫分析沙丁胺醇的電化學(xué)免疫傳感器。以茜素作為探針，二氧化鈦-乙炔黑-殼聚糖復(fù)合材料為修飾材料，通過電沉積金納米粒子進(jìn)一步增強電流響應(yīng)及實現(xiàn)沙丁胺醇抗體的固定。采用差分脈沖伏安法實現(xiàn)了沙丁胺醇的定量檢測，在1.0～100 μg/L范圍內(nèi)，該免疫傳感器表現(xiàn)出線性響應(yīng)，檢出限為0.67 μg/L。該免疫傳感器具有較好的重現(xiàn)性、選擇性和穩(wěn)定性，有望用于實際樣品中沙丁胺醇的檢測。

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