韓建勛，陳 穎*，王 斌，張九凱，馬秀麗

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心，北京 100176；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)，全球魚(yú)肉市場(chǎng)以次充好、摻假問(wèn)題層出不窮。有報(bào)道稱(chēng)，德國(guó)產(chǎn)鰈科魚(yú)的抽檢標(biāo)識(shí)不符比例達(dá)25%；在美國(guó)波士頓和洛杉磯，魚(yú)肉虛假標(biāo)識(shí)的比例分別高達(dá)48%和55%[1]。我國(guó)媒體也曾曝光國(guó)內(nèi)超市將油魚(yú)冒充鱈魚(yú)的事件。魚(yú)肉摻假問(wèn)題不僅影響國(guó)際間進(jìn)出口貿(mào)易秩序，而且會(huì)降低社會(huì)誠(chéng)信度，損害消費(fèi)者利益。

對(duì)于未加工魚(yú)類(lèi)，消費(fèi)者很容易靠外觀、形態(tài)、花紋及顏色進(jìn)行區(qū)分，但經(jīng)絞碎、研磨、烘烤、油炸等加工處理的無(wú)骨魚(yú)、魚(yú)糜、魚(yú)肉罐頭或生鮮調(diào)理食品等，則很難利用形態(tài)學(xué)鑒別。近年來(lái)科技人員采用光譜[2-4]、質(zhì)譜[5-6]、生物傳感[7]、PCR(Polymerase chain reaction)[8-9]、DNA條碼[10-13]等現(xiàn)代分析技術(shù)在魚(yú)肉真?zhèn)舞b別方面開(kāi)展了廣泛研究，取得了不錯(cuò)的成果。有研究采用近紅外光譜技術(shù)，結(jié)合主成分分析和BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)建立了青、草、鰱、鳙、鯉、鯽、魴7 種淡水魚(yú)的品種鑒別模型，準(zhǔn)確率達(dá)96.4%[4]。該技術(shù)前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快，但魚(yú)類(lèi)的光譜曲線易受不同養(yǎng)殖環(huán)境、不同產(chǎn)地等因素的影響，因此數(shù)據(jù)庫(kù)模型的構(gòu)建需大量代表性樣本。也有文獻(xiàn)通過(guò)構(gòu)建電化學(xué)生物傳感體系，檢測(cè)大西洋鮭與虹鱒特異PCR擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的差異循環(huán)伏安信號(hào)，從而鑒別魚(yú)肉樣品來(lái)源[7]，但實(shí)驗(yàn)檢測(cè)電極易吸附非特異DNA，進(jìn)而影響結(jié)果的特異性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以PCR為基礎(chǔ)的DNA分析技術(shù)已成為物種鑒定的主流。有文獻(xiàn)提出以COI(Cytochrome C oxidase I)基因?yàn)榘谢?，通過(guò)建立大西洋鮭的SYBR-Green 熔解曲線方法，可準(zhǔn)確鑒別大西洋鮭、紅鮭、銀鮭與大馬哈魚(yú)及其制品[14]，方法簡(jiǎn)便、成本低，但一次擴(kuò)增只能檢測(cè)1個(gè)物種，通量較低。也有報(bào)道利用大西洋鮭線粒體CR(Control region)區(qū)段設(shè)計(jì)特異性LAMP 引物，建立了大西洋鮭種類(lèi)鑒定的LAMP 檢測(cè)方法[15]。LAMP方法簡(jiǎn)便快速，但特異性引物設(shè)計(jì)難度較大。近幾年，DNA 條形碼技術(shù)在物種鑒別領(lǐng)域發(fā)展迅速。有研究以魚(yú)COI基因?yàn)槟繕?biāo)基因，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)調(diào)查深圳批發(fā)市場(chǎng)和超市零售魚(yú)肉制品的種類(lèi)來(lái)源，發(fā)現(xiàn)77份魚(yú)肉制品中有28份樣品的標(biāo)簽標(biāo)示不符，錯(cuò)標(biāo)率達(dá)36.36%[13]。DNA 條形碼技術(shù)鑒別物種雖然準(zhǔn)確率和通量高，但必須依賴(lài)DNA 測(cè)序技術(shù)，步驟多，成本高?？梢曅酒夹g(shù)作為一種利用特異探針雜交產(chǎn)生可見(jiàn)信號(hào)的基因芯片技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、通量高和結(jié)果肉眼可見(jiàn)的特點(diǎn)，已在病原微生物[16]、食源性過(guò)敏原[17]以及轉(zhuǎn)基因作物[18]檢測(cè)中得到應(yīng)用。

本文針對(duì)市場(chǎng)中常見(jiàn)的多寶魚(yú)、銀鯧魚(yú)、金槍魚(yú)、暗紋東方鲀、青石斑魚(yú)、帶魚(yú)、大黃魚(yú)以及東星斑魚(yú)8種魚(yú)類(lèi)，采用可視芯片技術(shù)建立了一種魚(yú)肉及其制品中8種魚(yú)源性成分的高通量快速檢測(cè)方法，旨在為魚(yú)肉制品的溯源和安全監(jiān)管提供新的技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材 料

1.1.1樣品大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)由遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供，青石斑魚(yú)(Epinephelusawoara)與東星斑魚(yú)(Plectropomusleopardus)由廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供，暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)由福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供，金槍魚(yú)(Thunnusthynnus)由上海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供，多寶魚(yú)(Psettamaxima)、帶魚(yú)(Benthodesmuselongatus)以及銀鯧魚(yú)(Pampusargenteus)購(gòu)自北京超市。所有魚(yú)肉樣品均在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2引物與探針?biāo)幸锱c探針均根據(jù)多寶魚(yú)、銀鯧魚(yú)、金槍魚(yú)、暗紋東方鲀、青石斑魚(yú)、帶魚(yú)、大黃魚(yú)以及東星斑魚(yú)的小清蛋白基因序列比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)。為避免雜交反應(yīng)出現(xiàn)假陰性，且作為探針陣列的定位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)中需要合成一段由20個(gè)腺嘌呤組成的陽(yáng)性對(duì)照(5′-ALD-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′-Biotin)。其中，魚(yú)肉通用-反向引物5′端進(jìn)行生物素(Biotin)標(biāo)記，在探針和陽(yáng)性對(duì)照的5′端進(jìn)行醛基(ALD)修飾，以使探針和陽(yáng)性對(duì)照能與芯片表面修飾的氨基結(jié)合固定。

表1 引物及探針序列Table 1 The sequence of primers and probes

1.1.3試劑與儀器EX Taq DNA polymerase、dNTPs、10×PCR 緩沖液購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；CTAB裂解液(20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris、20 mmol/L Na2-EDTA，pH 8.0)、CTAB沉淀液(5 g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl，pH 8.0)、1.2 mol/L NaCl等為自行配制；蛋白酶K、三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇等購(gòu)自北京宏捷有限公司。

微量移液器(10、20、100、1 000 μL，德國(guó)Eppendorf公司)，精密烘箱(Venticell，德國(guó) MMM公司)，恒溫均勻器(Thermomixer Comfort，德國(guó)Eppendorf公司)，電子天平(BS，德國(guó)Sartorius公司)，離心機(jī)(5804R，德國(guó)Eppendorf公司)，PCR擴(kuò)增儀(Mastercycler gradient，德國(guó)Eppendorf公司)，生物芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)(AD3200，美國(guó)BioDot公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品DNA提取取研磨過(guò)的魚(yú)肉原料或市售樣品0.1 g至2.0 mL離心管中，后續(xù)DNA提取參照文獻(xiàn)中的CTAB法[17]。

1.2.2常規(guī)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：DNA模板5 μL；10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL；dNTPs 2.0 μL；正/反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL；EX Taq DNA polymerase 0.3 μL，用無(wú)菌水補(bǔ)至總體積為25 μL。

擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

圖1 魚(yú)類(lèi)探針的可視芯片點(diǎn)樣圖Fig.1 Schematic diagram of capture probes for fish species on the chip1.Turbot(多寶魚(yú))；2.Silvery pomfret(銀鯧魚(yú))；3.Tuna(金槍魚(yú))；4.Obscura puffer(暗紋東方鲀)；5.Indigo hamlet(青石斑魚(yú))；6.Hairtail(帶魚(yú))；7.Large yellow croaker(大黃魚(yú))；8.Miniatus grouper(東星斑魚(yú))；P.Positive control(陽(yáng)性對(duì)照)(biotin-dA20)

1.2.3可視芯片的制備與雜交芯片的制備與雜交程序參照文獻(xiàn)[16]的方法。利用生物芯片點(diǎn)樣儀將多寶魚(yú)、銀鯧魚(yú)、金槍魚(yú)、暗紋東方鲀、青石斑魚(yú)、帶魚(yú)、大黃魚(yú)、東星斑魚(yú)以及陽(yáng)性對(duì)照等探針以十字形圖案方式進(jìn)行點(diǎn)樣(圖1)。

1.2.4可視芯片特異性分析單組分魚(yú)肉特異性分析：為驗(yàn)證魚(yú)類(lèi)探針的特異性，采用魚(yú)肉通用引物對(duì)分別擴(kuò)增多寶魚(yú)、銀鯧魚(yú)、金槍魚(yú)、暗紋東方鲀、青石斑魚(yú)、帶魚(yú)、大黃魚(yú)、東星斑魚(yú)等DNA，擴(kuò)增條件同“1.2.2”所述，將PCR產(chǎn)物分別與芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，用無(wú)菌水作空白對(duì)照。

多組分魚(yú)肉特異性分析：將多寶魚(yú)、銀鯧魚(yú)、金槍魚(yú)、暗紋東方鲀、青石斑魚(yú)、帶魚(yú)、大黃魚(yú)、東星斑魚(yú)8種魚(yú)類(lèi)DNA進(jìn)行等濃度(10 ng/μL)混合，利用魚(yú)肉通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同“1.2.2”所述，將PCR產(chǎn)物與芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，用無(wú)菌水作空白對(duì)照。

1.2.5可視芯片靈敏度分析將已測(cè)定濃度的多寶魚(yú)、銀鯧魚(yú)、金槍魚(yú)、暗紋東方鲀、青石斑魚(yú)、帶魚(yú)、大黃魚(yú)、東星斑魚(yú)等8種魚(yú)肉DNA，用無(wú)菌水稀釋至10 ng/μL，取10 μL 10 ng/μL DNA至90 μL無(wú)菌水中，得到1 ng/μL的DNA濃度，由此依次類(lèi)推得到0.1、0.01、0.001 ng/μL的DNA濃度。按照“1.2.2”條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別與芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，用無(wú)菌水作空白對(duì)照。

1.2.6市售樣品檢測(cè)為確證可視芯片方法的準(zhǔn)確性及適用性，選取7份市售魚(yú)肉加工樣品：鮮得味金槍魚(yú)罐頭、伊納寶金槍魚(yú)罐頭、五香黃花魚(yú)罐頭、三文魚(yú)松、古龍茄汁沙丁魚(yú)、石斑魚(yú)肉、東星斑魚(yú)肉，DNA提取后按照“1.2.2”條件進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物分別與芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，將檢測(cè)結(jié)果與樣品標(biāo)簽進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 引物及探針設(shè)計(jì)

目前常用于魚(yú)肉種類(lèi)鑒別的基因有線粒體COI基因、CR區(qū)段以及16S rDNA等，但經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)這些基因并不適用于同時(shí)設(shè)計(jì)8種魚(yú)類(lèi)的通用引物及特異探針?？紤]到作為魚(yú)類(lèi)主要過(guò)敏原的小清蛋白不僅廣泛存在于魚(yú)類(lèi)骨骼纖維中，而且具有物種特異性，現(xiàn)已成為研究不同物種之間親緣關(guān)系的重要工具[19]，因此選擇小清蛋白基因作為魚(yú)肉種類(lèi)鑒別的靶標(biāo)基因。

首先自行克隆測(cè)序了暗紋東方鲀(T.obscurus)、東星斑魚(yú)(C.miniata)、青石斑魚(yú)(H.indigo)、多寶魚(yú)(P.lethostigma)、大黃魚(yú)(L.xanthurus)、銀鯧魚(yú)(P.argenteus)以及帶魚(yú)(T.haumela)的小清蛋白基因序列，提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)后分別獲得序列號(hào)MF671767、MF671768、MF671769、MF671770、MF671771、MF671772、MF671773。同時(shí)從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載金槍魚(yú)的小清蛋白基因序列(GenBank：FN544082.1)。采用生物信息學(xué)軟件ClustralX比對(duì)不同品種魚(yú)的小清蛋白基因序列，在基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了魚(yú)通用引物，在非保守區(qū)設(shè)計(jì)了不同品種魚(yú)的特異性探針。序列比對(duì)結(jié)果如圖2所示。

圖2 魚(yú)類(lèi)小清蛋白基因序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 The results of the sequence alignments of parvalbumin gene in fishthe nucleotides followed arrows indicate the position of fish universal forward and reverse primer，the specific probes for eight fish species are shown in red color(箭頭對(duì)應(yīng)序列代表魚(yú)的通用正/反向引物序列，紅色加粗標(biāo)記序列代表特異性探針序列)

2.2 可視芯片特異性結(jié)果

圖3 單組分魚(yú)肉可視芯片特異性結(jié)果Fig.3 Specificity detection result of single-fish species on thin-film biosensor chips1.Turbot；2.Silvery pomfret；3.Tuna；4.Obscura puffer；5.Indigo hamlet；6.Hairtail；7.Large yellow croaker；8.Miniatus grouper

圖4 多組分魚(yú)肉可視芯片特異性結(jié)果Fig.4 Specificity detection result of multiple-fish species on thin-film biosensor chips1.Turbot；2.Silvery pomfret；3.Tuna；4.Obscura puffer；5.Indigo hamlet；6.Hairtail；7.Large yellow croaker；8.Miniatus grouper

2.2.1單組分魚(yú)肉特異性分析依照實(shí)驗(yàn)預(yù)先設(shè)計(jì)的十字型芯片圖案，陽(yáng)性對(duì)照位點(diǎn)全部呈現(xiàn)明顯的信號(hào)，多寶魚(yú)、銀鯧魚(yú)、金槍魚(yú)、暗紋東方鲀、青石斑魚(yú)、帶魚(yú)、大黃魚(yú)、東星斑魚(yú)8種魚(yú)的靶標(biāo)探針位點(diǎn)也均呈現(xiàn)明顯信號(hào)，與陽(yáng)性對(duì)照的信號(hào)相當(dāng)，且與背景信號(hào)明顯區(qū)分，而同一張芯片上的其他非靶標(biāo)探針位點(diǎn)則完全與背景一致，沒(méi)有任何信號(hào)(圖3)，說(shuō)明本研究設(shè)計(jì)的探針可特異性檢出多寶魚(yú)、銀鯧魚(yú)、金槍魚(yú)、暗紋東方鲀、青石斑魚(yú)、帶魚(yú)、大黃魚(yú)以及東星斑魚(yú)成分。

2.2.2多組分魚(yú)肉特異性分析圖4是可視芯片高通量檢測(cè)魚(yú)類(lèi)的特異性結(jié)果。芯片中陽(yáng)性對(duì)照的信號(hào)全部清晰顯現(xiàn)，所有魚(yú)類(lèi)探針位點(diǎn)的信號(hào)明顯，均可與背景清晰地區(qū)分，說(shuō)明該方法可同時(shí)檢出8種魚(yú)類(lèi)成分。實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，不同魚(yú)的探針位點(diǎn)雜交信號(hào)強(qiáng)度存在差異性，其原因可能是靶標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物與特異探針的雜交反應(yīng)受到其他擴(kuò)增產(chǎn)物或探針的干擾，但檢測(cè)信號(hào)與背景均可明顯區(qū)分，不影響其高通量檢測(cè)8種魚(yú)類(lèi)的準(zhǔn)確性，且整個(gè)可視芯片檢測(cè)過(guò)程僅需約35 min。相比一次擴(kuò)增只能檢測(cè)1個(gè)物種的實(shí)時(shí)熒光PCR方法、LAMP方法等，該方法具有明顯的通量?jī)?yōu)勢(shì)；相較通量更高的測(cè)序技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)在于結(jié)果肉眼可見(jiàn)，檢測(cè)時(shí)間短，一般測(cè)序技術(shù)上機(jī)檢測(cè)1個(gè)樣本至少需2～3 h，且測(cè)序數(shù)據(jù)需經(jīng)序列比對(duì)才能獲得最終檢測(cè)結(jié)果，耗時(shí)較長(zhǎng)，數(shù)據(jù)分析專(zhuān)業(yè)性較強(qiáng)。

圖5 多寶魚(yú)的可視芯片靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The detection limit result of Turbot on thin-film biosensor chips1-5：10，1.0，0.1，0.01，0.001 ng/μL

2.3 可視芯片靈敏度結(jié)果

將多寶魚(yú)、銀鯧魚(yú)、金槍魚(yú)、暗紋東方鲀、青石斑魚(yú)、帶魚(yú)、大黃魚(yú)以及東星斑魚(yú)DNA分別稀釋至10、1.0、0.1、0.01、0.001 ng/μL，將其PCR產(chǎn)物與可視芯片分別進(jìn)行雜交反應(yīng)。以多寶魚(yú)為例，當(dāng)DNA為0.01 ng/μL時(shí)，芯片上特異結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生微弱信號(hào)，當(dāng)DNA為0.001 ng/μL時(shí)，芯片上特異結(jié)合位點(diǎn)無(wú)信號(hào)產(chǎn)生，與背景顏色一致，表明方法檢測(cè)多寶魚(yú)的靈敏度為0.01 ng/μL(圖5)。同樣，得到銀鯧魚(yú)、暗紋東方鲀、帶魚(yú)、東星斑魚(yú)的檢測(cè)靈敏度為0.01 ng/μL，青石斑魚(yú)、金槍魚(yú)以及大黃魚(yú)的檢測(cè)靈敏度為0.1 ng/μL。

2.4 市售樣品檢測(cè)結(jié)果

為驗(yàn)證方法的可行性，利用已建立的可視芯片方法對(duì)7份市售樣品開(kāi)展多寶魚(yú)、銀鯧魚(yú)、金槍魚(yú)、暗紋東方鲀、青石斑魚(yú)、帶魚(yú)、大黃魚(yú)以及東星斑魚(yú)等成分的檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。兩份金槍魚(yú)罐頭均檢出標(biāo)識(shí)的金槍魚(yú)成分，東星斑魚(yú)肉檢出標(biāo)識(shí)的東星斑魚(yú)成分，說(shuō)明該檢出結(jié)果與標(biāo)簽一致；五香黃花魚(yú)罐頭檢出大黃魚(yú)成分，石斑魚(yú)肉檢出青石斑魚(yú)成分，但樣品標(biāo)簽中未明確標(biāo)識(shí)大黃魚(yú)、青石斑魚(yú)成分；三文魚(yú)松以及古龍茄汁沙丁魚(yú)兩份樣品標(biāo)簽中無(wú)上述8種魚(yú)成分標(biāo)識(shí)，且樣品中也均未檢出8種魚(yú)類(lèi)成分。以上說(shuō)明，本研究建立的可視芯片方法可用于市售魚(yú)肉樣品中8種魚(yú)源性成分的檢測(cè)。

表2 市售樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 2 The detection results of commercial products

+：detected；-:no detected

3 結(jié) 論

針對(duì)魚(yú)肉市場(chǎng)常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)品種摻假問(wèn)題，本研究以多寶魚(yú)、銀鯧魚(yú)、金槍魚(yú)、暗紋東方鲀、青石斑魚(yú)、帶魚(yú)、大黃魚(yú)以及東星斑魚(yú)8種魚(yú)類(lèi)為研究對(duì)象，根據(jù)小清蛋白基因序列設(shè)計(jì)了8種魚(yú)的通用引物以及特異性探針，利用可視芯片技術(shù)建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏、便捷的可同時(shí)檢測(cè)8種魚(yú)類(lèi)的高通量檢測(cè)方法，為我國(guó)魚(yú)肉市場(chǎng)的安全監(jiān)管以及檢驗(yàn)檢疫口岸的現(xiàn)場(chǎng)快速通關(guān)提供了新的技術(shù)支撐。

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