王常普，蔡小平

1.濮陽市中醫(yī)院，河南 濮陽 457001；2.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004

驚厥是兒科較常見的急癥，好發(fā)于6個月～5歲兒童，驚厥反復發(fā)作或處于持續(xù)狀態(tài)而未能有效治療時，可造成進行性腦損傷，給家庭及社會帶來沉重負擔[1]。鉤藤堿是鉤藤的主要有效成分之一，化學結(jié)構(gòu)屬于吲哚類生物堿[2]，鉤藤堿的藥理作用廣泛，具有降低血壓、收縮外周血管、降低血管阻力、抗血小板聚集、鎮(zhèn)靜以及抗驚厥等作用[3]，但對驚厥性腦損傷是否有保護作用未見報道。本研究通過建立驚厥持續(xù)狀態(tài)大鼠模型，觀察驚厥并給藥后大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)水平和海馬Toll樣受體4(TLR4)表達的動態(tài)變化，為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 18日齡SD大鼠，SPF級，雄性，160只，體質(zhì)量60～70 g，河南省實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫)2015-0004，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。SPF級實驗室由河南省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK(豫)2012-0009。

1.2 實驗試劑 鉤藤堿(成都德思特生物技術(shù)有限公司)；匹魯卡品、氯化鋰(美國Sigma公司)；硫酸阿托品注射液(湖北科倫藥業(yè)有限公司)；SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗TLR4多克隆抗體、SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實驗儀器 680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)；RM2245型病理切片機(德國徠卡公司)；GL-20B型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.4 分組與模型制備 SD幼年大鼠腹腔注射氯化鋰(120 mg/kg)，18 h后腹腔注射阿托品(1 mg/kg)以拮抗匹魯卡品外周膽堿能反應(yīng)，30 min后腹腔注射匹魯卡品(100 mg/kg)，觀察并記錄大鼠驚厥發(fā)作級別。0級：無發(fā)作跡象；1級：面部抽動；2級：點頭、濕狗樣抖動；3級：前肢陣攣抽搐；4級：全身強直伴后肢站立；5級：全身強直痙攣。驚厥發(fā)作4級以上且時間持續(xù)達30 min，驚厥緩解后狀態(tài)良好的大鼠為合格大鼠模型[4]。模型復制成功大鼠隨機分為模型組、鉤藤堿低劑量組、鉤藤堿中劑量組、鉤藤堿高劑量組4組，每組32只，另取32只正常幼年大鼠作為正常組，各組再按時間點隨機分為4 h、24 h、48 h和72 h 4個亞組，每個亞組8只。鉤藤堿低、中、高劑量組于造模后分別給予鉤藤堿[10、20、40 mg/(kg·d)]腹腔注射，每天1次，連用3天，正常組、模型組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.5 血清SOD測定 按照預(yù)定時間點用烏拉坦麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，羥胺法測定血清SOD活性。

1.6 海馬組織TLR4的表達測定 取大鼠腦組織后快速分離海馬組織，4%多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋后切片，二甲苯脫蠟后乙醇水化，修復抗原，滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，正常山羊血清封閉，TLR4一抗孵育過夜，滴加生物素化二抗，37℃孵育，滴加SABC，孵育，DAB顯色后復染，顯微鏡下觀察并采集圖像。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析TLR4免疫反應(yīng)陽性的平均光密度值(Mean Optical Density，MOD)。每張切片隨機取3個視野分析，取其平均值。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計量資料以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清SOD水平比較 見表1。模型組大鼠驚厥后4 h血清SOD活性降低，48 h達到峰值，4個時間點模型組大鼠血清SOD值均低于正常組(P＜0.01)。與模型組比較，鉤藤堿各劑量組大鼠血清SOD活性均顯著升高，以24 h、48 h和72 h時較明顯(P＜0.05，P＜0.01)，鉤藤堿各劑量組大鼠血清SOD活性隨著鉤藤堿劑量增大而增強，呈劑量依賴關(guān)系。

表1 各組大鼠血清SOD水平比較(±s) U/mL

表1 各組大鼠血清SOD水平比較(±s) U/mL

與正常組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

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2.2 各組大鼠海馬組織TLR4表達比較 見表2。模型組大鼠驚厥后4 h海馬組織TLR4的表達增加，48 h達到峰值，4個時間點模型組大鼠海馬組織TLR4的表達均高于正常組(P＜0.01)。與模型組比較，鉤藤堿各劑量組大鼠海馬組織TLR4的表達均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，鉤藤堿各劑量組大鼠海馬組織TLR4的表達隨著鉤藤堿劑量增大而減少。

表2 各組大鼠海馬組織TLR4表達比較(±s) 平均光密度值

表2 各組大鼠海馬組織TLR4表達比較(±s) 平均光密度值

與正常組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別T L R 4的表達正常組模型組鉤藤堿低劑量組鉤藤堿中劑量組鉤藤堿高劑量組n 8 8 8 8 8 4 h 0.1 2 4±0.0 2 6 0.2 4 1±0.0 4 3①0.1 9 3±0.0 3 1②0.1 6 6±0.0 2 9③0.1 4 6±0.0 2 4③2 4 h 0.1 3 1±0.0 2 4 0.3 2 7±0.0 4 6①0.2 4 2±0.0 4 1③0.1 8 9±0.0 3 3③0.1 5 5±0.0 2 5③4 8 h 0.1 2 8±0.0 2 5 0.4 7 3±0.0 5 8①0.3 4 4±0.0 4 7③0.2 1 2±0.0 3 8③0.1 6 9±0.0 2 8③7 2 h 0.1 2 9±0.0 2 6 0.4 0 6±0.0 6 9①0.2 8 1±0.0 5 4③0.1 7 2±0.0 2 8③0.1 5 0±0.0 2 6③

3 討論

驚厥是兒科常見的急癥，尤多見于嬰幼兒，表現(xiàn)為突然的全身或局部肌群呈強直性和陣攣性抽搐，常伴有意識障礙，其在兒童時期的發(fā)生率較一般人群高5～10倍，發(fā)病率約為3%～5%。一次驚厥發(fā)作持續(xù)30min以上或反復多次發(fā)作且間歇期意識不恢復者稱為驚厥持續(xù)狀態(tài)，其中20%的患者為反復發(fā)作或持續(xù)狀態(tài)。驚厥反復發(fā)作或持續(xù)狀態(tài)會危及患者生命或產(chǎn)生嚴重的后遺癥，影響智力發(fā)育和健康，因此及時控制驚厥發(fā)作對患兒生長發(fā)育具有積極的意義。

驚厥常導致機體代謝明顯加強，能量消耗增加，氧供應(yīng)不足，腦組織缺氧，產(chǎn)生大量的氧自由基。氧自由基不但可以通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化反應(yīng)攻擊腦細胞脂質(zhì)膜，而且通過脂質(zhì)氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細胞損傷，導致細胞膜構(gòu)型和結(jié)構(gòu)的破壞[5]。SOD是機體清除體內(nèi)氧自由基的重要酶之一，SOD活性的高低間接反應(yīng)了機體清除氧自由基的能力[6]。本研究顯示，大鼠驚厥后4 h血清SOD活性開始降低，48 h達到最低值，至72 h時血清SOD活性仍低于正常大鼠。

TLR4是一種跨膜識別受體，分為細胞外、細胞膜和細胞內(nèi)3部分，是TLRs家族中最復雜的成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可表達于神經(jīng)細胞、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞等。TLR4活化后，TIR結(jié)構(gòu)域與下游接頭分子Mal/TIRAP和TRAM/TRIF結(jié)合，主要通過TRIF和MyD88依賴的兩條信號通路激活NF-κB，活化的NF-κB進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，激活I(lǐng)L-1、IL-6、IL-8、TNF-β等細胞因子的表達[7]，誘導細胞凋亡。TLR4在驚厥小鼠的腦實質(zhì)、海馬組織、室管膜、微脈管系統(tǒng)和脈絡(luò)叢等周圍的神經(jīng)細胞、星型膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞均大量表達，抑制TLR4后驚厥發(fā)作程度減輕。本研究顯示，大鼠驚厥后海馬組織TLR4的表達增加，與臨床報道一致[8]。

鉤藤是我國常用中藥材，對中樞神經(jīng)、心血管和血液系統(tǒng)等具有廣泛的藥理作用，鉤藤對中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表現(xiàn)為鎮(zhèn)靜、抗癲癇、抗驚厥和對神經(jīng)元的保護等。鉤藤堿是鉤藤的主要有效成分之一，毒性低，副作用較小，臨床用于治療高血壓、哮喘、癲癇等疾病。本實驗結(jié)果表明，鉤藤堿能降低驚厥持續(xù)狀態(tài)幼年大鼠血清SOD水平和海馬組織TLR4的表達，且呈劑量依賴關(guān)系，這可能是鉤藤堿鎮(zhèn)靜抗癲癇的作用機制之一。

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