黃巧勝， 陳少鋒， 鐘澤龍， 王衛(wèi)東， 張 濤， 余曉霞， 李國成， 伍俊妍， 許林鋒

雷替曲塞為抗代謝類葉酸類似物，是一種胸苷酸合成酶（TS）抑制劑［1］。TS是胸腺嘧啶脫氧核苷三磷酸鹽（TTP）合成過程的關鍵酶，而TTP是DNA合成的必需核苷酸。因此通過抑制TS可導致DNA斷裂和細胞凋亡。雷替曲塞進入細胞內，很快代謝成一系列對TS抑制作用更強的多聚谷氨酸鹽貯存在細胞內，而且其在細胞內潴留的時間更長，從而更有效抑制細胞DNA的合成，更加持續(xù)地發(fā)揮抗腫瘤作用。

張鑫等［2］通過小豬模型研究了雷替曲塞動脈持續(xù)灌注化療期間在動物體內的藥動學特征，基于以上的研究基礎及臨床現狀，本研究通過建立兔肝VX2腫瘤模型，采用液相色譜串聯(lián)質譜檢測方法［3］，檢測經股靜脈灌注、肝動脈灌注、肝動脈碘油混懸液注入、肝動脈灌注后明膠海綿栓塞給藥后5、10、15、30、45min 和 1、3、6、12、24 h 股靜脈血中藥物濃度，考察雷替曲塞不同給藥方式藥動學特征，補充雷替曲塞用于肝動脈灌注栓塞治療原發(fā)性肝癌的藥動學數據，為臨床試驗的開展和臨床推廣提供更多的基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象及瘤株 新西蘭大白兔40只，雌雄各半，3～5月齡，體重 2.0～2.5 kg（由廣州市花都區(qū)花東信華實驗動物養(yǎng)殖場提供）。VX2荷瘤種兔由華中科技大學附屬協(xié)和醫(yī)院饋贈。實驗設計經中山大學動物實驗倫理委員會討論批準。

1.1.2 藥品和試劑 雷替曲塞對照品（純度為99.7%，由南京正大天晴制藥有限公司提供）；內標物為氟康唑對照品（純度99.8%，國家藥品標準物質，批號100314-201204）；試驗用水為重蒸去離子水；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純。

1.1.3 儀器 Aglitent 1200高效液相色譜法儀，Aglient 6420 triple quad LC/MS，Agilent色譜化學工作站，Milli-Q Gradient A10超純水器（Millipore Inc.USA），XS25DU 電子天平（瑞士 METTLER TOLEDO），XW-80A渦旋混合器（原上海醫(yī)科大學儀器廠），Centrifuge 5424高速離心機（德國Eppendrof）。

1.2 方法

1.2.1 兔VX2肝腫瘤模型建立 兔肝VX2腫瘤模型是非常成熟的動物模型，具有接種簡單、成功率高的特點，容易制成原位腫瘤動物模型，同時兔肝VX2腫瘤為目前國內做大動物的實驗性肝癌模型，其供血動脈主要為肝動脈的富血管性的浸潤性生長的實體腫瘤。具體過程：①切取種植于種兔大腿內側的VX2生長旺盛的呈魚肉樣的腫瘤組織塊，剪成2～3mm的組織小塊，浸泡在加有慶大霉素的4℃0.9%NaCl溶液保存?zhèn)溆谩＂谟?0%水合氯醛按2.5ml/kg腹腔注射進行全身麻醉，將兔子仰臥位固定于動物手術臺上，予上腹部備皮，清潔后用安爾碘Ⅲ型皮膚消毒液進行消毒2次，范圍約15 cm，鋪上無菌洞巾。于劍突下正中間約1 cm處皮下注射2%利多卡因進行局部麻醉，在局麻處沿腹白線作一長約3 cm正中切口，依次分離皮膚、筋膜、肌肉、腹膜，撐開切口，用無菌棉簽小心夾取暴露肝左葉，再用潤濕紗布包裹肝臟小心牽拉出腹腔，用眼科鑷刺破肝包膜，形成一竇道，接著夾取0.9%NaCl溶液中備好的 VX2腫瘤組織塊植入竇道內，最后夾取明膠海綿條塞入竇道口止血，回納肝臟，確保內臟恢復解剖關系后，逐層縫合腹壁，術后當日慶大霉素1萬U腹腔注射，每天1次給予肌內注射芐星青霉素6萬IU/kg，連續(xù)3 d。2周后應用MRI檢查或開腹直視下對模型動物進行成瘤成功判定并評定腫瘤大小和位置。

1.2.2 實驗動物分組 40只肝VX2腫瘤模型兔隨機分為A，B，C，D，4組，每組10只。A組為雷替曲塞股靜脈灌注組，經股靜脈留置針灌注藥物，維持給藥時間為15 min，B組為雷替曲塞肝動脈灌注組，C組為雷替曲塞肝動脈碘油混懸液注入組，D組為雷替曲塞肝動脈灌注后明膠海綿栓塞組。B，C，D組實驗兔均在DSA造影機引導下，經股動脈引入微導管至肝固有動脈，然后經微導管注入藥物，根據實驗動物與人的等效劑量比值折算［3］，每只實驗兔注入藥物總量為0.50 mg，維持每次給藥時間為15 min。

1.2.3 標本采集方法 A、B、C、D 4組動物分別于給藥后 5、10、15、30、45 min 和 1、3、6、12、24 h 通過股靜脈留置針于股靜脈采血，每個時間點采血1ml，置于肝素化試管中，離心收集上層血漿置于EP管中，-20℃冰箱保存待測。

1.2.4 雷替曲塞血漿藥物濃度檢測方法建立

1.2.4.1 分析條件：色譜柱為Agilent Zorbax SBC18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈∶水（含0.1%甲酸）（20 ∶80，V ∶V）；流速：0.2m l/min；柱溫：25℃；進樣量為2μl。質譜條件：電噴霧電離源（ESI），正離子化，掃描方式為選擇性離子監(jiān)測，雷替曲塞（m/z 459.1→173.1）和氟康唑（m/z 307.1→238.3），毛細管電壓 4 000 V，噴霧氣壓力 40 PSI，干燥氣體流速10 L/min，干燥氣體溫度350℃，雷替曲塞和氟康唑的碰撞能量分別為42ev，14ev，裂解電壓分別為105 V，110 V，電子倍增器200 V。

1.2.4.2 標準溶液的配制：分別精密稱取雷替曲塞、氟康唑對照品適量（分別含雷替曲塞、氟康唑各10 mg），分別置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，即配制成濃度為0.2mg/ml的貯備液。將雷替曲塞儲備液用流動相稀釋成40、200、1 000、2 000、10 000、20 000 和 40 000 ng/ml的標準工作液。另稀釋配置濃度為2 000 ng/ml的內標氟康唑甲醇溶液。

1.2.4.3 血漿樣品處理方法：精密吸取家兔血漿200μl于EP管中，加入內標（2 000 ng/ml氟康唑甲醇溶液）10 μl，振蕩混勻，加入甲醇 800 μl，渦旋振蕩1min后，于15 000 r/min離心 10min，吸取上清液置另一EP管中，42℃真空干燥至干，進樣前加入甲醇100μl，渦旋30 s使殘渣溶解，于15 000 r/min離心10min，吸取上清液2μl進樣。

圖1 測定血漿中雷替曲塞和氟康唑的MRM色譜圖

1.2.4.4 方法專屬性：取6份不同來源的空白血漿各100μl，在“1.2.4.3血漿樣品處理方法”項依法操作，獲得空白血漿樣品的色譜圖，如圖1①；將一定濃度的標準溶液和內標溶液加入空白血漿中，依同法操作獲得相應的色譜圖，如圖1②，雷替曲塞、氟康唑的保留時間分別約為3.0、6.3min；取家兔注射雷替曲塞后收集的血漿樣品，依同法操作，得色譜圖1③④。結果表明，空白血漿中的內源性物質不干擾雷替曲塞及內標氟康唑的測定。

1.2.4.5 標準曲線和定量下限：取雷替曲塞對照品儲備液適量，加入空白家兔血漿，稀釋成2，10，50，100，200，1 000，2 000 ng/ml的血漿標準曲線樣品，按“2.5血漿樣品處理”項處理后進行LC-MS/MS測定。以血漿中雷替曲塞濃度與內標濃度之比為橫坐標（X），藥物峰與內標峰面積比值為縱坐標（Y），權重系數為1/χ2，最小二乘法進行回歸運算，得直線回歸方程即為血漿中雷替曲塞，定量下限為2 ng/ml（S/N＞5）。雷替曲塞在2～2 000 ng/ml范圍內線性良好（r＞0.99），典型代表方程為：Y＝0.500844X＋0.005816。配制6份2 ng/ml的血漿樣品，按標準曲線方法分別處理測定，測得結果的RSD＜15%。

1.2.4.6 方法精密度、準確度和提取回收率：低（10 ng/ml）、中（100 ng/ml）、高（1 000 ng/ml）濃度的質控樣品，各5份，連續(xù)測定3 d，根據當天的標準曲線，測定樣品濃度，計算樣品結果準確度和精密度。另取空白血漿，除不加雷替曲塞溶液和內標外，按“1.2.4.3”項方法操作。取上清液稀釋雷替曲塞和內標至相應濃度，進樣分析。以每一濃度2種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。精密度和提取回收率結果見表1。

表1 雷替曲塞精密度、準確度及提取回收率

1.2.4.7 基質效應考察及穩(wěn)定性考察：取18管空白血漿各200μl平分為三組，每組6管，加入甲醇800μl，渦旋振蕩 1min后，于15 000 r/min離心10 min，吸取上清液置另一EP管中，42℃真空干燥至干。 殘渣中加入低（200 ng/ml）、中（2 000 ng/ml）、高（20 000 ng/ml）的雷替曲塞和氟康唑（2 000 ng/ml）各 10 μl，加入甲醇 80 μl，渦旋 30 s，于 15 000 r/min離心 10 min；另取18管EP管平分為3組，每組6管，殘渣中加入低（200 ng/ml）、中（2 000 ng/ml）、高（20 000 ng/ml）的雷替曲塞和氟康唑（2 000 ng/m l）各 10 μl，另加入甲醇 80 μl，渦旋 30 s，于 15 000 r·min離心10min。2種方法測得的雷替曲塞峰面積的比值計算基質因子，并除以內標的基質因子，計算經內標歸一化的基質因子。結果6批基質計算的內標歸一化基質因子變異系數為14.2%，小于15%。

取血漿樣品低（10 ng/ml）、中（100 ng/ml）、高（1 000 ng/ml）3種濃度分別在室溫放置24 h、凍融3次，結果表明樣品基本穩(wěn)定，RSD＜15%。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。應用DAS2.0軟件進行藥動學分析。

2 結果

A、B、C、D 4 組給藥后，tmax均為 5 min；t1/2（h）分別為（5.88±1.39），（7.31±2.60），（9.86±5.10），（7.19±2.27），其中C組t1/2最長，與A組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）； Cmax分別為（2 056.40±139.17），（1 389.21±180.28），（911.84±105.62），（1 133.41±181.42） ng/ml·h，A 組 Cmax明顯高于 B， C， D 3組，差異具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），其中C組最低；AUC0-t分別為（5482.72±1007.07），（4156.99±1475.77），（2 785.13±1 107.36），（3 903.64±947.25） ng/ml·h，A組AUC0-t明顯高于B，C，D 3組，差異具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），其中C組最低。見表2。

表2 用DAS2.0軟件計算雷替曲塞在血漿中的藥動學參數

表2 用DAS2.0軟件計算雷替曲塞在血漿中的藥動學參數

注： 與 A 組比較 a P＜0.05，b P＜0.01，c P＞0.05

組別AUC0-t/（ng/m l·h） AUC0-∞/（ng/m l·h） C max/（ng/m l） t1/2/h A 5 482.72±1 007.07 5 507.38±1022.90 2 056.40±139.17 5.88±1.39 B 4 156.99±1 475.77a 4 213.34±1508.12a 1 389.21±180.28c 7.31±2.60 C 2 785.13±1 107.36b 2 868.56±1176.87b 911.84±105.62a 9.86±5.10 D 3 903.64±947.25b 3 956.80±994.10b 1 133.41±181.42c 7.19±2.27

3 討論

圖2 A、B、C、D 4組平均藥時曲線圖

原發(fā)性肝癌是我國高發(fā)的惡性腫瘤，由于起病隱襲，早期診斷困難和進展迅速，確診時大多數已達局部晚期或發(fā)生遠處轉移，治療棘手，生存期較短，預后極差。現階段主要的治療手段仍然是根治性切除手術［4］，但臨床上不少病例確診時已不適宜行手術切除術，手術切除率僅約為20%，另外肝癌手術切除后有較高的復發(fā)率，復發(fā)的患者中有很大一部分患者也無法再行手術切除。TACE已成為原發(fā)性肝癌及肝轉移的主要的治療方法之一［5-6］，已成為公認的不能手術切除原發(fā)性肝癌的首選，而且在能切除的肝癌、有癌栓的肝癌及肝臟轉移癌的治療中也得到了應用，安全可靠。目前常用的化療藥物有5-FU、雷替曲塞、阿霉素、表阿霉素、絲裂霉素、羥基喜樹堿、鉑類藥物等［7］，但目前國內闡述經肝動脈灌注/灌注栓塞的藥動學的研究比較少。

不同給藥方式，藥物在體內的代謝過程不一樣，經動脈給藥后，藥物首先由血漿分布至靶組織，然后進入系統(tǒng)循環(huán)，再分布到其他組織中去［8］，而靜脈注射后，藥物首先經過系統(tǒng)循環(huán)，再分布至靶組織。

化療藥物對腫瘤細胞的最大殺傷效果主要取決于局部組織藥物的濃度（C）和藥物與腫瘤細胞的作用時間（T），即C×T值的大小，經動脈給藥可以使C×T 的值遠遠高于其他給藥途徑［9］。

動脈化療已在多種實體性腫瘤的治療中廣泛應用［10-14］，因為其血漿中的藥物峰濃度及AUC值相對較低，全身毒性相對較低，具有一定優(yōu)勢。Maurer等［9］的研究結果表明：動脈區(qū)域灌注化療時腫瘤邊緣化療藥物濃度是全身化療時的9～68倍。高濃度、長時間的抗癌藥物集中于癌腫組織中，必定會使大量腫瘤細胞受到抑制，療效得到提高。另一方面經動脈區(qū)域灌注給藥可減少抗癌藥物與血漿蛋白結合，局部游離藥物濃度明顯增加，從而使抗癌藥物的療效得到提高。

研究表明雷替曲塞的抗癌效果不僅僅來源于藥物本身，給藥后48 h內只有55%的雷替曲塞以藥物原型被排泄，一部分藥物通過還原型葉酸甲氨蝶呤細胞膜被細胞主動攝取，從而被葉酸聚谷氨酸合成酶代謝成一系列多聚谷氨酸類化合物，此類化合物對胸苷酸合酶有著更強的抑制作用，且能長時間潴留在細胞內，發(fā)揮長期毒性［15-16］。

張鑫等［2］的研究中，發(fā)現雷替曲塞動脈持續(xù)灌注化療可以在足夠的時間內保持局部組織內較高血藥濃度，且外周血中濃度極低，有利于提高局部腫瘤藥物濃度直接殺死腫瘤細胞，降低全身不良反應。

本研究通過兔肝VX2腫瘤模型，利用介入治療的技術經股動脈引入微導管至肝固有動脈進行動脈灌注化療或肝動脈化療栓塞，考察雷替曲塞經股靜脈灌注、肝動脈灌注、肝動脈碘油混懸液注入、肝動脈灌注后明膠海綿栓塞給藥的藥動學情況。

研究結果顯示A，B，C，D 4組給藥后，A組其AUC0-t為（5 482.72±1 007.07）（ng/ml·h）明顯高于B，C，D 3組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），是 C 組的1.97倍，D組的1.40倍，B組的1.32倍，這說明經動脈給藥后，藥動學發(fā)生了一定的變化，經動脈給藥后外周血漿中AUC值要明顯比靜脈給藥低，其中C組經股動脈碘油混懸液注入AUC值最低。這說明經動脈給藥后，血漿中分布的藥物相對減少，可能有更多的藥物沉積到靶組織，其中C組經動脈碘油混懸液注入尤為明顯。實體腫瘤組織內往往新生血管豐富，血流量大，碘化油與雷替曲塞混懸劑經動脈推注，大部分在虹吸作用下選擇性地流向腫瘤區(qū)［8］，并且能夠緩慢釋放，使得在一定時間范圍內腫瘤局部藥物濃度升高，而血漿藥物濃度相對較低，且保留更長的時間，因此經肝動脈碘油混懸液推注有可能增強化療療效的作用。B，C，D組給藥化療藥物在血漿中的峰濃度（Cmax）和藥時曲線下面積（AUC）均比A組小，C組t1/2為9.86 h，相對其他組差異具有統(tǒng)計學意義，也說明藥物的碘油混懸液沉積于腫瘤靶區(qū)后，有可能在局部維持高濃度的同時，緩慢釋放藥物，使腫瘤靶區(qū)有較長的藥物接觸時間。因此C組經動脈碘油混懸液注入可能將對腫瘤細胞發(fā)揮最大殺傷效果，還能最大限度降低全身不良反應。

雷替曲塞經肝動脈給藥，首先接觸的靶器官是肝臟，然后進入系統(tǒng)循環(huán)，再分布到其他組織中去，本研究結果顯示外周血漿AUC值及Cmax值均顯著小于靜脈組。這表明經動脈給藥增加腫瘤靶區(qū)藥物濃度的同時，對全身產生的毒副作用可能減小，提高患者耐受程度。血藥濃度并不是判定藥效的唯一標準，組織細胞內濃度也是決定藥效的重要因素。雷替曲塞經不同給藥方式后在肝組織中以及腫瘤組織分布情況，值得進行進一步深入研究。

［1］ Barni S， Ghidini A， Coinu A， et al.A systematic review of raltitrexed-based first-line chemotherapy in advanced colorectal cancer［J］.Anticancer Drugs， 2014， 25： 1122-1128.

［2］ 張 鑫，朱林忠，朱 旭，等.雷替曲塞持續(xù)動脈灌注化療的藥動學研究［J］.中國實驗診斷學，2016，20：8-11.

［3］ 陳 平.雷替曲塞在大鼠血漿和腦組織中的分布研究［J］.安徽醫(yī)學，2013，34：174-176.

［4］ Qi X， Wang D， Su C， et al.Hepatic resection versus transarterial chemoembolization for the initial treatment of hepatocellular carcinoma：a systematic review and meta-analysis［J］.Oncotarget， 2015， 6： 18715-18733.

［5］ Qi X，Liu L，Wang D，et al.Hepatic resection alone versus in combinationwith pre-and post-operative transarterialchemoembolization for the treatment of hepatocellular carcinoma： A systematic review and meta-analysis［J］.Oncotarget， 2015， 6：36838-36859.

［6］ 許 飛，李忱瑞，孫 偉，等.原發(fā)性肝癌TACE術中雷替曲塞的臨床應用［J］.介入放射學雜志，2017，26：418-421.

［7］ Kim DW， Talati C， Kim R.Hepatocellular carcinoma （HCC）：beyond sorafenib-chemotherapy［J］.JGastrointest Oncol， 2017，8：256-265.

［8］ Arai Y， Takeuchi Y， Inaba Y， et al.Percutaneous catheter placement for hepatic arterial infusion chemotherapy［J］.Tech Vasc Interv Radiol， 2007， 10： 30-37.

［9］ Maurer CA，BornerM，BuchlerMW，etal．Regional chemotherapy of gastrointestinal cancer［J］．Dig Surg， 1997， 14： 9-22.

［10］ Beale P， Judson I， Hanwell J.Metabolism， excretion and pharmacokinetics of a single dose of 14C-raltitrexed in cancer patients［J］.Cancer Chemother Pharmacol， 1998， 42： 71-76.

［11］孫 賓，李 興，宋 杰，等.進展期胃癌術前介入治療的臨床應用［J］.實用放射學雜志， 2014， 27： 2054-2057.

［12］王良忠，李寧毅，馬 霖，等.氟尿嘧啶和卡鉑周圍靜脈給藥與舌動脈灌注栓塞后藥動學實驗研究［J］.齊魯醫(yī)學雜志，2006，21：193-196.

［13］ StefaniniGF，Anorati P，BiselliM，et al.Efficacy of transarterial targeted treatments on survival of patients with hepatpcellular carcinoma.An Italian experience［J］.Cancer， 1995， 75： 2427-2434.

［14］賀紅杰，宋 磊，趙丹懿，等.雷替曲塞聯(lián)合奧沙利鉑經TACE治療不可切除肝癌患者的療效評價［J］.介入放射學雜志，2016，25：40-43.

［15］ Kameyama M， Imaoka S， Fukuda I， et al.Delayed washout of intratumor blood flow is associated with good response to intraarteral chemoembolization for liver metastasis of colorectal cancer［J］.Surgery， 1993， 114： 97-101.

［16］ Shigehara K， Kitagawa Y， Nakashima T， et al．Squamous cell carcinoma of the bladder：a patient treated successfully with a new combined chemotherapy regimen，intraarterial nedaplatin and pirarubicin plus intravenousmethotrexate and vincristine［J］．Int JCIin oncol， 2006， 1l： 329-331．