張崟，郭思亞，熊偉，向鵬妍，吳婷，孟婧，張婷

(成都大學(xué)肉類(lèi)加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610106)

畜禽及水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物，如畜禽骨、畜禽皮、魚(yú)皮、魚(yú)鱗、魚(yú)頭、魚(yú)骨、魚(yú)鰭等，其中含有豐富的膠原蛋白。由于膠原蛋白中甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的含量較高，所以常用其制備氨基酸或作為補(bǔ)充甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的蛋白質(zhì)原料。近年來(lái)，有關(guān)膠原蛋白功能性的最新研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白水解所得的膠原肽，不僅表現(xiàn)出很好的可消化性，而且還具有保護(hù)胃黏膜、抗氧化、抗?jié)?、抗衰老、抗過(guò)敏、降血壓、促進(jìn)軟骨再生、促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的修復(fù)和生長(zhǎng)，促進(jìn)皮膚膠原代謝、免疫調(diào)節(jié)等諸多獨(dú)特的生理活性[1-3]。因此，水解膠原蛋白制備肽的工藝及膠原肽的功能性研究越來(lái)越多地受到國(guó)內(nèi)外科研機(jī)構(gòu)的重視。

目前，常用的制備膠原肽的方法主要有酸法、堿法和酶法[4,5]。酸法和堿法均采用化學(xué)試劑促使膠原蛋白分解產(chǎn)生小分子肽。這兩種水解方法不僅過(guò)程難以控制，而且反應(yīng)比較強(qiáng)烈，會(huì)造成氨基酸變性，產(chǎn)生有毒物質(zhì)等不利結(jié)果[6]。因此，使用可替代化學(xué)法的酶法水解膠原蛋白技術(shù)日益受到重視。酶法水解膠原蛋白不僅反應(yīng)條件溫和，具有較高的回收率，而且水解反應(yīng)速率快，對(duì)環(huán)境污染較小，所得膠原肽較酸法和堿法更安全。因此，被廣泛應(yīng)用于功能性食品、化妝品及其他產(chǎn)品開(kāi)發(fā)[7]。為了更好地促進(jìn)酶法水解膠原制備肽工藝改進(jìn)和對(duì)酶解肽功能性的研究，本文對(duì)近年來(lái)有關(guān)酶法水解膠原蛋白制備肽的工藝進(jìn)行了對(duì)比分析。

1 膠原蛋白概述

膠原蛋白又名膠原質(zhì)，是一種白色、不透明、無(wú)支鏈的纖維狀結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。膠原分子有著典型的長(zhǎng)且堅(jiān)韌的三螺旋結(jié)構(gòu)，由2條α1肽鏈和1條α2肽鏈組成。3條α肽鏈交互纏繞形成繩索狀的超螺旋結(jié)構(gòu)。每條肽鏈的序列為連續(xù)重復(fù)的Gly-X-Y(X為脯氨酸，Y為羥脯氨酸或羥賴(lài)氨酸)[8]。

2 酶解膠原肽的功能性及用途

膠原蛋白獨(dú)特的三股超螺旋結(jié)構(gòu)使其具有十分穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，微弱的酸很難使其分解。因此膠原蛋白難以被人體直接消化利用。但是，將膠原蛋白水解，形成分子量較小的膠原多肽后，可顯著提高其生物利用性，更有利于被人體吸收和利用[9]。酶法水解膠原蛋白制備膠原肽的原理是通過(guò)蛋白酶，如膠原酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等對(duì)其進(jìn)行水解，得到多肽[10]。

常見(jiàn)的酶解膠原蛋白制備膠原肽的反應(yīng)條件、所得肽的功能性及用途見(jiàn)表1。酶解膠原蛋白所得肽具有抗氧化、ACE抑制、抗菌活性，其主要用途包括清除自由基、防止脂質(zhì)過(guò)氧化、降血壓及抗菌?？蓪⒚附饽z原肽添加到點(diǎn)心、乳制品及其他食品中，改善食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[11]。還有將膠原蛋白肽添加于飲料中，制作體能恢復(fù)性飲料的報(bào)道。近年來(lái)，酶解膠原蛋白制備膠原肽的研究已全面展開(kāi)，而且隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)膠原蛋白肽研究的不斷深入，膠原肽的功能性及其利用價(jià)值將會(huì)被更多地發(fā)掘。

表1 酶解膠原蛋白的產(chǎn)物特性及其用途Table 1 Characteristics and applications of enzymatic hydrolysates of collagen

注：ACE指血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme)。

3 酶解膠原蛋白工藝分類(lèi)

膠原蛋白的來(lái)源及其類(lèi)型不同，其中的氨基酸構(gòu)成及多肽的種類(lèi)會(huì)出現(xiàn)差異。在采用酶法水解膠原蛋白時(shí)，酶的選擇和酶解工藝對(duì)膠原肽的制備有重要影響。通過(guò)分析近年來(lái)國(guó)內(nèi)外膠原蛋白的酶解工藝發(fā)現(xiàn)，目前酶解膠原蛋白的工藝主要分為單酶水解和多酶水解兩種方法，其中多酶水解法又分為混合酶水解法或分步酶水解法。酶解膠原蛋白的工藝選取通常應(yīng)考慮要開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品對(duì)肽分子量的要求。如果欲得到分子量較小的膠原多肽，一般采用多酶水解法，反之則采用單酶水解法[24]。

3.1 單酶水解法

在單酶水解膠原蛋白工藝建立上，國(guó)內(nèi)外研究人員多在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)或響應(yīng)面法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，然后建立最優(yōu)的酶解工藝[25-27]。采用單酶水解膠原蛋白的酶解工藝及酶解效果比較見(jiàn)表2。

表2 單酶酶解膠原蛋白工藝比較Table 2 Comparison of enzymatic hydrolysis of collagen protein with one proteinase

續(xù) 表

由表2可知，在原料方面，涉及的畜禽加工副產(chǎn)物包括畜禽骨、皮；水產(chǎn)加工副產(chǎn)物包括鱗、皮、肉及骨，其中畜禽加工副產(chǎn)物中酶解骨膠原制備肽的工藝較多；在水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物方面，水解魚(yú)鱗膠原的報(bào)道較多。

在酶的來(lái)源方面，以外加蛋白酶居多，其次是采用內(nèi)源性蛋白酶水解膠原制備肽。酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間及pH對(duì)酶解效果影響大，以魚(yú)鱗為例，采用菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶水解，兩者的水解度差異近2倍。

畜禽骨的水解度在1.613%～32.46%變化。在水產(chǎn)加工副產(chǎn)物方面，可能受原料和酶解條件的共同影響，水解度的變化較大，在1.46%～36.2%變化，其中羅非魚(yú)下腳料的水解度最高。在水解產(chǎn)物功能性方面，單酶水解效果多采用水解度評(píng)價(jià)水解效果，其次是膠原蛋白提取率、自由基清除率及ACE抑制活性。

3.2 混合酶水解法

由于酶的專(zhuān)一性，采用單酶水解膠原蛋白時(shí)，只能分解其中一些具有特定結(jié)構(gòu)的肽鍵。因此，底物結(jié)構(gòu)對(duì)單酶水解效果影響較大。隨著水解時(shí)間增加，水解度不會(huì)再增加，而且水解程度受限，所得膠原肽的分子量一般較大。為了避免單酶水解的這一缺陷，近年來(lái)出現(xiàn)了采用多種酶混合法對(duì)膠原蛋白進(jìn)行水解的報(bào)道(見(jiàn)表3)。多種蛋白酶的混合，可以發(fā)揮不同酶的水解特性，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，實(shí)現(xiàn)對(duì)膠原蛋白的多位點(diǎn)分解。因此，所得酶解產(chǎn)物的水解度較高，有利于提高底物轉(zhuǎn)化率，縮短水解時(shí)間[64]。多酶水解還可以減少因?yàn)閱蚊杆獠粡氐?，造成疏水性氨基酸含量較高而引起酶解液苦味較重[65]、酶解液風(fēng)味不足、腥味較重等不利結(jié)果[66,67]。

表3 混合酶水解膠原蛋白工藝Table 3 Comparison of enzymatic hydrolysis of collagen protein with poly-proteinase

由表3可知，在原料方面，混合酶解用到的畜禽副產(chǎn)物包括豬骨、雞骨及雞皮、豬皮，水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物方面有魚(yú)皮及魚(yú)鱗。在酶的混合方式方面，以雙酶酶解居多，其次是三酶水解，尚未見(jiàn)有4種或更多酶復(fù)合酶解的報(bào)道。比較表2和表3中豬皮的水解度可知，多酶酶解使豬皮的水解度提高了近1倍，由單酶水解度9.55%到雙酶水解度17.7%。在酶解效果評(píng)價(jià)方面，目前報(bào)道的文獻(xiàn)主要有水解度和肽回收率對(duì)酶解效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，未見(jiàn)對(duì)酶解肽的功能性評(píng)價(jià)。

3.3 分步酶水解法

蛋白酶按作用位點(diǎn)可分為內(nèi)切酶和外切酶。內(nèi)切酶的種類(lèi)主要有胃蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶；外切酶主要有菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、動(dòng)物蛋白水解酶。內(nèi)切酶從肽鏈內(nèi)部將多肽水解成小片斷，外切酶作用于肽鏈末端的肽鍵，逐個(gè)將氨基酸水解下來(lái)。在混合酶水解膠原蛋白基礎(chǔ)上，應(yīng)用復(fù)合酶分步水解，在酶解第一階段先使用內(nèi)切酶，使蛋白質(zhì)顆粒水解成肽片段，第二階段再使用肽鏈外切酶進(jìn)一步水解，減小肽鏈的長(zhǎng)度，降低水解液中的疏水氨基酸的比率，進(jìn)一步提高水解度和改善風(fēng)味[76,77]。分步復(fù)合酶水解膠原蛋白，能克服單一酶解反應(yīng)中酶解程度受限，混合酶水解時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)酶相互抑制的問(wèn)題。分步酶解的缺點(diǎn)是工藝復(fù)雜，酶解效果還要根據(jù)相應(yīng)指標(biāo)如水解度、酶解物風(fēng)味及抗氧化性等來(lái)確定。近年來(lái)報(bào)道的分步酶水解膠原蛋白工藝比較見(jiàn)表4。

表4 分步酶水解膠原蛋白工藝Table 4 Comparison of enzymatic hydrolysis of collagen protein with proteinase step by step

由表4可知，在原料方面，分步酶解采用的畜禽副產(chǎn)物原料有畜禽皮和骨，水產(chǎn)副產(chǎn)物方面主要是骨和皮。分步酶解采用的酶多為雙酶，其次是三酶水解，尚未見(jiàn)有4種或更多酶分步酶解的報(bào)道。在酶解效果方面，涉及的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括水解度、自由基清除率、鈣離子螯合率及ACE抑制活性。比較表2和表3發(fā)現(xiàn)，分步酶解涉及的原料還比較少。因此，未來(lái)可在酶分步水解方面做更多探索。

4 膠原蛋白酶解過(guò)程存在的問(wèn)題

盡管目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)對(duì)膠原蛋白的酶解工藝開(kāi)展了較為廣泛的研究，但是目前尚存在的問(wèn)題：(1)酶解效率不高。因膠原蛋白的天然硬質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶解效率低，產(chǎn)物的回收率不高的現(xiàn)象較普遍。以水解度為例，單酶水解度最高的尚達(dá)不到50%，但導(dǎo)致問(wèn)題的機(jī)理尚不清楚。(2)原料的一致性有待改進(jìn)。畜禽及水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的差異，導(dǎo)致酶解制備膠原肽的原料一致性難以保障。原料的一致性會(huì)引起后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。(3)酶的種類(lèi)與水解效果缺乏統(tǒng)一。從本文中的酶解膠原文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)使用的原料較廣泛，采用的酶種類(lèi)也較多，尚缺乏酶的種類(lèi)和原料酶解效果的統(tǒng)一，這直接導(dǎo)致工業(yè)化應(yīng)用時(shí)缺乏依據(jù)。

5 結(jié)論

我國(guó)是畜禽和水產(chǎn)品生產(chǎn)大國(guó)，每年產(chǎn)生的畜禽及水產(chǎn)品副產(chǎn)物量大，如何將這些副產(chǎn)物高附加值利用，減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，是直接影響我國(guó)畜禽及水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵制約因素。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)在畜禽及水產(chǎn)品副產(chǎn)物利用萬(wàn)面開(kāi)展了一些探索。隨著我國(guó)的環(huán)境保護(hù)要求越來(lái)越高，節(jié)能、綠色、環(huán)保的新技術(shù)在畜禽及水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物回收利用中的應(yīng)用將越來(lái)越受到重視。本文對(duì)近年來(lái)有關(guān)低污染、高效、節(jié)能的生物酶解技術(shù)在畜禽及水產(chǎn)品副產(chǎn)物利用的研究進(jìn)展進(jìn)行了對(duì)比分析，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，在膠原酶解工藝方面，主要以單酶水解工藝居多，其次是多酶水解技術(shù)。在原料方面，涉及更多的骨、鱗及皮。在產(chǎn)物評(píng)價(jià)方法方面，更多的是采用水解度、自由基抑制率及肽的提取率、ACE抑制活性。在今后的研究中，期待在酶解效率提高及其機(jī)理探索、膠原肽的功能性評(píng)價(jià)、原料一致性及酶的種類(lèi)差異與酶解效果評(píng)價(jià)關(guān)系方面有更多探索。

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