姜薇薇

(山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品藥品學(xué)院，濟(jì)南 250103)

老陳醋是我國(guó)著名的食醋，生產(chǎn)歷史悠久。它用大麥、碗豆等原料自然通風(fēng)制曲，再以高粱為主要原料配以其他輔料，采用低溫酒精發(fā)酵，通過(guò)熏醅、淋醋、日曬與撈冰，制得色澤黑紫、質(zhì)地濃稠、 酸味醇厚、具有特殊香味的老陳醋[1]。但是陳醋在儲(chǔ)存過(guò)程中容易發(fā)生沉淀、返渾等問(wèn)題一直是食醋行業(yè)多年來(lái)亟待解決的問(wèn)題。據(jù)研究報(bào)道，食醋產(chǎn)生沉淀、返渾問(wèn)題主要是由以下原因引起的：一是陳醋在釀造過(guò)程中存在未完全分解的淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)在后期儲(chǔ)存中發(fā)生聚沉，致使產(chǎn)品發(fā)生非生物性的渾濁沉淀現(xiàn)象[2]。二是生產(chǎn)過(guò)程中因操作不規(guī)范導(dǎo)致產(chǎn)品被微生物污染，出現(xiàn)生物性的渾濁和變質(zhì)，嚴(yán)重影響食醋的感官質(zhì)量及其商品價(jià)值[3]。本文從陳醋儲(chǔ)存過(guò)程中非生物性的沉淀、返渾角度出發(fā)，探究陳醋產(chǎn)品中殘留的不同分子量物質(zhì)對(duì)陳醋儲(chǔ)存過(guò)程中沉淀物的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

陳醋原醋：山東某陳醋釀造公司提供；鹽酸、NaOH等化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Pellicon-2膜過(guò)濾設(shè)備 美國(guó)默克密理博公司；L-8900氨基酸全自動(dòng)分析儀 日本日立公司；ET76020濁度儀 美國(guó)Lovibond公司；pHS-2F pH 計(jì) 上海雷磁儀器廠；電子分析天平 上海京孚儀器有限公司；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀 海能(濟(jì)南)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基本成分分析

蛋白質(zhì)的測(cè)定：依照GB 5009.5-2010進(jìn)行；灰分的測(cè)定：依照GB 5009.4-2010進(jìn)行；脂肪的測(cè)定：依照GB 5009.6-2016進(jìn)行；總酸的測(cè)定：依照GB/T 5009.41-1996進(jìn)行；總糖的測(cè)定：依照文獻(xiàn)[4]的總糖測(cè)定方法進(jìn)行。

1.2.2 陳醋沉淀物收集方法

稱取一定量的陳醋樣品，以轉(zhuǎn)速2000 r/min離心1 min，收集沉淀物，105 ℃干燥，即為陳醋沉淀物[5]。

1.2.3 不同分子量殘留陳醋液的制備

本實(shí)驗(yàn)共選擇6種有機(jī)濾膜，截留分子量分別為250，200，150，100，70，50 kDa分別對(duì)陳醋原液進(jìn)行膜過(guò)濾實(shí)驗(yàn)，依照殘留分子量大小分別得到原醋液、陳醋液1(殘留分子量<250 kDa)、陳醋液2(殘留分子量<200 kDa)、陳醋液3(殘留分子量<150 kDa)、陳醋液4(殘留分子量<100 kDa)、陳醋液5(殘留分子量<70 kDa)、陳醋液6(殘留分子量<50 kDa)，其中具體過(guò)濾條件參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

1.2.4 氨基酸組成及含量分析

稱取一定量的樣品于20 mL水解管中，加入10 mL 6 mol/L的HCl溶液，抽真空至7 Pa后封口。將水解管置于110 ℃恒溫烘箱內(nèi)水解24 h后冷卻，混勻，開(kāi)管，過(guò)濾，吸取適量濾液，60 ℃抽真空蒸干，加入3～5 mL pH 2.2的檸檬酸鈉緩沖液，搖勻，離心，取上清液，以外標(biāo)法于安捷倫AG1100型氨基酸專用液相色譜儀定量測(cè)定[7]。

1.2.5 濁度的測(cè)定方法

使用Lovibond公司的ET76020型濁度儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定條件參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

1.2.6 陳醋的儲(chǔ)存性實(shí)驗(yàn)方法

將本實(shí)驗(yàn)制備的不同分子量殘留的陳醋液，在室溫儲(chǔ)存條件下，進(jìn)行為期300天的儲(chǔ)存性實(shí)驗(yàn)，觀察不同儲(chǔ)存時(shí)間陳醋液品質(zhì)的變化。

1.2.7 陳醋色度的測(cè)定方法

色度在420，520，620 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定[8]。

1.2.8 陳醋感官品質(zhì)的測(cè)定方法

陳醋的感官評(píng)定方法：在文獻(xiàn)[9]方法的基礎(chǔ)上略作改動(dòng)，選取20名專業(yè)的感官評(píng)定員組成感官評(píng)定小組，根據(jù)色澤、香氣、滋味、形態(tài)4個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，其中感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1，最終得到陳醋的感官評(píng)分為20位專業(yè)感官評(píng)分員的平均分。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria

2 結(jié)果與討論

2.1 陳醋沉淀物基本成分分析

表2 陳醋沉淀物的基本成分分析(以干基計(jì))Table 2 Analysis of the basic components of mature vinegar precipitate (on dry basis) %

由表2可知，陳醋中渾濁沉淀的主要成分為蛋白質(zhì)，含量高達(dá)76.41%，其次是糖類，含量為14.87%，脂肪和灰分的含量相對(duì)較低，僅為4.30%和4.42%。這是由于陳醋在發(fā)酵過(guò)程中，原料中部分蛋白質(zhì)和淀粉分解不完全，產(chǎn)生了一些分子量較大的多肽和多糖，這些大分子量的物質(zhì)在后續(xù)的加工工藝和運(yùn)輸、儲(chǔ)存、銷售等環(huán)節(jié)中，隨著時(shí)間的增加可在部分離子的作用下與多酚類物質(zhì)結(jié)合，產(chǎn)生沉淀，使陳醋出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象[10]，因此沉淀中的主要成分為蛋白質(zhì)和糖類。

2.2 不同分子量殘留陳醋中各組分分析

本文共選擇6種有機(jī)濾膜，截留分子量分別為250，200，150，100，70，50 kDa分別對(duì)陳醋原液進(jìn)行膜過(guò)濾實(shí)驗(yàn)，依次得到原醋液、陳醋液1(殘留分子量<250 kDa)、陳醋液2(殘留分子量<200 kDa)、陳醋液3(殘留分子量<150 kDa)、陳醋液4(殘留分子量<100 kDa)、陳醋液5(殘留分子量<70 kDa)、陳醋液6(殘留分子量<50 kDa)7種含有不同分子量殘留的陳醋液。經(jīng)分析，7種陳醋液中各組分見(jiàn)表3。

表3 不同分子量殘留陳醋中基本組分分析Table 3 Analysis of the basic components of mature vinegar residues with different molecular weight g/dL

由表3可知，膜過(guò)濾對(duì)陳醋總酸和灰分的影響不大，隨著濾膜的孔徑逐漸減小，陳醋液中無(wú)鹽固形物、蛋白質(zhì)、糖類及脂類的含量逐漸減少，其中無(wú)鹽固形物及蛋白質(zhì)的減少量最大。對(duì)比陳醋原液和陳醋液1的基本組成成分可知，經(jīng)250 kDa的濾膜過(guò)濾后陳醋液中的各組分改變最大，含量減少最為明顯。這是因?yàn)殛惔滓涸诎l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白類多肽、多糖、已失活的菌體等大分子被除去，從而顯著改變了各組分的含量[11]。

2.3 不同分子量殘留陳醋儲(chǔ)存過(guò)程中濁度的變化

2.3.1 大分子量物質(zhì)(>250 kDa)對(duì)濁度的影響

將陳醋原液和陳醋液1在常溫正常儲(chǔ)存條件下進(jìn)行儲(chǔ)存性試驗(yàn)，儲(chǔ)存過(guò)程中濁度的變化見(jiàn)圖1。

圖1 大分子量物質(zhì)(>250 kDa)對(duì)陳醋儲(chǔ)存過(guò)程中濁度的影響Fig.1 The effects of macromolecular substances(>250 kDa)on turbidity of mature vinegar during storage

由圖1可知，陳醋液1(殘留分子量<250 kDa)在長(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程中的濁度明顯低于陳醋原液的濁度。在經(jīng)過(guò)整個(gè)300天的儲(chǔ)存周期后，陳醋原醋的濁度由初始的2.5 NTU升高為8.8 NTU，濁度升高了6.3 NTU。陳醋液1(殘留分子量<250 kDa)的濁度由初始的0.63 NTU升高為2.8 NTU，濁度升高了2.17 NTU，濁度變化相對(duì)較小，由此可知，陳醋原液中含有的大分子量物質(zhì)(殘留分子量>250 kDa)是引起陳醋濁度變化的主要物質(zhì)。

由圖1可知，陳醋原醋儲(chǔ)存前60天，濁度的變化較小，曲線升高較緩慢，儲(chǔ)存時(shí)間在60～210天時(shí)，陳醋原液的濁度變化最大，圖中曲線較陡，從3.2 NTU升高至8.3 NTU，儲(chǔ)存時(shí)間在210～300天時(shí)，濁度變化不大。陳醋液1(殘留分子量<250 kDa)儲(chǔ)存前120天濁度基本沒(méi)有發(fā)生變化，僅由最初的0.63 NTU升高至0.90 NTU，儲(chǔ)存時(shí)間在120～240天時(shí)，濁度變化相對(duì)較大，從0.90 NTU升高至2.76 NTU，之后隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，濁度基本維持不變。對(duì)比兩條曲線可知，陳醋液在儲(chǔ)存過(guò)程中，前120天出現(xiàn)濁度升高現(xiàn)象主要是由其內(nèi)部殘留的大分子量物質(zhì)(殘留分子量>250 kDa)絮凝沉淀產(chǎn)生的，而分子量小于250 kDa的物質(zhì)，在儲(chǔ)存時(shí)間120天開(kāi)始產(chǎn)生沉淀絮凝，使醋的濁度增加。

2.3.2 中分子量物質(zhì)(100～250 kDa)對(duì)濁度的影響

4種陳醋液(陳醋液1、陳醋液2、陳醋液3、陳醋液4)在常溫正常儲(chǔ)存過(guò)程中濁度的變化見(jiàn)圖2。

圖2 中分子量物質(zhì)(<250 kDa)對(duì)陳醋儲(chǔ)存過(guò)程中濁度的影響Fig.2 The effects of medium molecular substances(<250 kDa) on turbidity of mature vinegar during storage

由圖2可知，儲(chǔ)存0天時(shí)，4種陳醋液的濁度相差不大，而經(jīng)過(guò)300天的儲(chǔ)存性試驗(yàn)，4種陳醋液的濁度均發(fā)生了明顯的升高，其中陳醋液1(殘留分子量<250 kDa)濁度升高了2.17 NTU，陳醋液2(殘留分子量<200 kDa)濁度升高了1.92 NTU，陳醋液3(殘留分子量<150 kDa)濁度升高了1.65 NTU，陳醋液4(殘留分子量<100 kDa)濁度升高了1.32 NTU，由此可知，殘留分子量越大，對(duì)濁度的影響越大，儲(chǔ)存后陳醋的渾濁度越高。另外，由圖2可知，4種陳醋液在前120天的儲(chǔ)存過(guò)程中，濁度的變化均不大，這也意味著在該儲(chǔ)存時(shí)間段中陳醋液中絮凝產(chǎn)生沉淀物質(zhì)的量相對(duì)較少。陳醋液1、陳醋液2在第120天時(shí)濁度開(kāi)始逐漸升高，而陳醋液3、陳醋液4則是在儲(chǔ)存時(shí)間150天后才逐漸開(kāi)始不斷升高。這種不同表明了這4種陳醋中的部分物質(zhì)，因分子量的不同，在各自不同的儲(chǔ)存時(shí)間下開(kāi)始產(chǎn)生絮凝，使得陳醋濁度升高。經(jīng)分析可知，陳醋儲(chǔ)存過(guò)程中120～150天產(chǎn)生的濁度升高，主要是由150～250 kDa分子量范圍內(nèi)物質(zhì)絮凝沉淀產(chǎn)生的。而陳醋中分子量<150 kDa的物質(zhì)，主要在儲(chǔ)存150天后才會(huì)不斷絮凝產(chǎn)生沉淀，引起陳醋濁度的變化。

2.3.3 小分子量物質(zhì)(<100 kDa)對(duì)濁度的影響

3種陳醋液(陳醋液4、陳醋液5、陳醋液6)在常溫正常儲(chǔ)存過(guò)程中濁度的變化見(jiàn)圖3。

圖3 小分子量物質(zhì)(<100 kDa)對(duì)陳醋儲(chǔ)存過(guò)程中濁度的影響Fig.3 The effects of small molecular substances(<100 kDa) on turbidity of mature vinegar during storage

由圖3可知，3種陳醋液在儲(chǔ)存0天時(shí)，濁度均處于較低的水平，在儲(chǔ)存的前150天，3種陳醋液的濁度升高較少。這表明陳醋中分子量<100 kDa的物質(zhì)，在儲(chǔ)存前150天內(nèi)能較好地保持穩(wěn)定，很少絮凝產(chǎn)生沉淀或已產(chǎn)生絮凝但未達(dá)到沉淀及改變濁度的狀態(tài)。隨著儲(chǔ)存時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，3種陳醋液在不同儲(chǔ)存時(shí)間，分別出現(xiàn)濁度升高的現(xiàn)象，其中陳醋液4，在儲(chǔ)存150天后，其濁度快速升高，陳醋液5在儲(chǔ)存時(shí)間150～180天之間開(kāi)始出現(xiàn)濁度快速升高的現(xiàn)象，而陳醋液6則在儲(chǔ)存180天濁度開(kāi)始快速增加。這表明陳醋儲(chǔ)存過(guò)程中150～180天范圍內(nèi)產(chǎn)生的濁度升高，主要是由50～100 kDa分子量范圍內(nèi)物質(zhì)絮凝沉淀產(chǎn)生的。而陳醋中分子量<50 kDa的物質(zhì)，主要在儲(chǔ)存180天后才會(huì)不斷絮凝產(chǎn)生沉淀，引起陳醋濁度的變化。

綜上所述，陳醋液在正常儲(chǔ)存過(guò)程中，前120天出現(xiàn)濁度升高現(xiàn)象主要是由其內(nèi)部殘留的大分子量物質(zhì)(分子量>250 kDa)絮凝沉淀產(chǎn)生的，儲(chǔ)存時(shí)間120～150天范圍內(nèi)產(chǎn)生的濁度升高，主要是由150～250 kDa分子量范圍內(nèi)物質(zhì)絮凝沉淀產(chǎn)生的。儲(chǔ)存時(shí)間范圍在150～180天內(nèi)產(chǎn)生的濁度升高，主要是由50～100 kDa分子量范圍內(nèi)物質(zhì)絮凝沉淀產(chǎn)生的。而陳醋中分子量<50 kDa的物質(zhì)，主要在儲(chǔ)存180天后才會(huì)不斷絮凝產(chǎn)生沉淀，引起陳醋濁度的變化。

2.4 不同分子量殘留對(duì)陳醋最終沉淀物的影響

不同分子量殘留的陳醋液經(jīng)過(guò)300天常溫儲(chǔ)存試驗(yàn)后產(chǎn)生沉淀的量不同，不同分子量殘留對(duì)陳醋最終沉淀物的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同分子量殘留對(duì)陳醋沉淀物的影響Fig.4 The effects of residues with different molecular weight on mature vinegar precipitates

由圖4可知，隨著殘留分子量的不斷減小，陳醋液中最終沉淀物的量不斷降低，其中陳醋原液最終沉淀物的量最多，為0.113 g/dL。且陳醋原液經(jīng)濾膜后，最終沉淀物的量顯著減少，陳醋液1(殘留分子量<250 kDa)、陳醋液2(殘留分子量<200 kDa)、陳醋液3(殘留分子量<150 kDa)，3種陳醋液儲(chǔ)存后最終沉淀物的量差別不大，分別為0.051，0.046，0.043 g/dL，明顯高于陳醋液4(殘留分子量<100 kDa)中0.033 g/dL、陳醋液5(殘留分子量<70 kDa)中0.030 g/dL、陳醋液6(殘留分子量<50 kDa)中0.029 g/dL 3種陳醋液中最終沉淀物的量。

2.5 不同分子量殘留對(duì)陳醋色度的影響

不同分子量殘留對(duì)陳醋液色度的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同分子量殘留對(duì)陳醋色度的影響Fig.5 The effects of residues with different molecular weight on chroma of mature vinegar

由圖5可知，不同分子量殘留對(duì)色度的影響不大。這是因?yàn)殛惔椎纳珴芍饕轻勗炝鞒讨醒に囍挟a(chǎn)生的類黑精類物質(zhì)賦予的，而這類賦予陳醋良好色澤的類黑精的分子量較小，僅有小部分處于10～80 kDa，絕大部分處于10 kDa以下[12]，因此，本文選擇的6種膜過(guò)濾，孔徑較大，基本不會(huì)將其除去，所以對(duì)色度的影響不大。

2.6 不同分子量殘留對(duì)陳醋感官品質(zhì)的影響

不同分子量殘留對(duì)陳醋感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖6。

圖6 不同分子量殘留對(duì)陳醋感官評(píng)分的影響Fig.6 The effects of residues with different molecular weight on sensory score of mature vinegar

由圖6可知，當(dāng)儲(chǔ)存天數(shù)為0天時(shí)，隨著殘留分子量的不斷降低，陳醋液的感官評(píng)分呈現(xiàn)先基本不變后逐漸降低的趨勢(shì)，但總體變化相對(duì)較小。這是因?yàn)閮?chǔ)存時(shí)間0天時(shí)，250，200，150，100，70，50 kDa的膜過(guò)濾僅僅除去部分多肽和糖類等相對(duì)大一些的物質(zhì)，對(duì)類黑精、總酸、乙醛、乙酸乙酯、乙醇、乙酸丙酯等小分子物質(zhì)的影響不大，因此對(duì)色澤、滋味及風(fēng)味方面基本沒(méi)有影響[13]。但70，50 kDa的膜過(guò)濾，膜的孔徑相對(duì)較小，會(huì)使得陳醋液中部分多肽和多糖損失，從而使得陳醋液的體態(tài)變稀，從而降低陳醋液5、陳醋液6的感官評(píng)分。

當(dāng)7種陳醋液經(jīng)過(guò)300天后，感官評(píng)分均有不同程度的降低，由圖6可知，不同分子量殘留對(duì)陳醋感官評(píng)分的影響呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但總體影響不大。這是因?yàn)榻?jīng)過(guò)300天的儲(chǔ)存，陳醋原液產(chǎn)生較多的沉淀，從而使得陳醋原液的濁度升高，對(duì)陳醋體態(tài)的影響較大，從而降低了陳醋原液的感官評(píng)分。而隨著殘留分子量的不斷減小，這一影響逐漸減弱，使得各陳醋液的感官評(píng)分呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，當(dāng)殘留分子量<100 kDa時(shí)，陳醋液的感官評(píng)分達(dá)到最大值為82.3。而陳醋液5、陳醋液6的感官評(píng)分較低則是因?yàn)榍捌?0，50 kDa的膜使得陳醋液中部分多肽和多糖損失、陳醋體態(tài)變稀，降低了其感官評(píng)分。雖然后期儲(chǔ)存過(guò)程中，其產(chǎn)生的沉淀較少，感官評(píng)分的降低較少，但其最終的感官評(píng)分值仍較低。

2.7 不同分子量殘留陳醋中氨基酸組成及含量分析

不同分子量殘留陳醋液中氨基酸組成分析見(jiàn)表4。

由表4可知，7種陳醋液中氨基酸的含量有較大的不同，且隨著陳醋液中殘留分子量的不斷降低，陳醋液中總的氨基酸含量呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)。其中陳醋原液中氨基酸的總含量最高，為8.30 mg/mL，陳醋液1、陳醋液2、陳醋液3、陳醋液4、陳醋液5中氨基酸的含量依次為7.15，6.79，6.64，6.36，5.88 mg/mL，陳醋液6中的氨基酸總量最低，為5.73 mg/mL。依照Lozano等[14]的方法計(jì)算各陳醋液中殘留蛋白的平均疏水性，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 氨基酸的平均疏水性與最終沉淀物的相關(guān)性分析Table 5 The correlation analysis between average hydrophobicity and precipitates

注：“**”表示在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

由表5可知，隨著濾膜分子量的不斷降低，各陳醋液中殘留蛋白質(zhì)和多肽的平均疏水性不斷降低。而蛋白質(zhì)或多肽分子的疏水性越強(qiáng)，越容易在儲(chǔ)存過(guò)程中相互絮凝產(chǎn)生沉淀[15]。

為了研究殘留蛋白質(zhì)或多肽的平均疏水性和最終沉淀物的量的關(guān)系，本文分析了平均疏水性和最終沉淀物的量的相關(guān)性。由表5可知，各陳醋液中最終沉淀物的量與其殘留蛋白質(zhì)或多肽的平均疏水性呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.895。

3 結(jié)論

本文從陳醋儲(chǔ)存過(guò)程中非生物性的沉淀角度出發(fā)，以6種濾膜進(jìn)行超濾制備不同分子量殘留的陳醋液，來(lái)探究陳醋中殘留不同分子量物質(zhì)對(duì)儲(chǔ)存過(guò)程中沉淀物的影響。研究表明：沉淀物的主要成分為蛋白質(zhì)，含量高達(dá)76.41%。不同分子量物質(zhì)在儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生絮凝沉淀的時(shí)間不同，前120天是由分子量>250 kDa的物質(zhì)絮凝產(chǎn)生的沉淀。120～150天范圍內(nèi)是由150～250 kDa分子量范圍的物質(zhì)絮凝產(chǎn)生的沉淀。150～180天內(nèi)，則是由50～100 kDa分子量范圍的物質(zhì)絮凝產(chǎn)生的沉淀。而陳醋中分子量<50 kDa的物質(zhì)，主要在儲(chǔ)存180天后才會(huì)不斷絮凝沉淀，引起陳醋濁度的變化。并且隨著陳醋液中殘留分子量越大越多，陳醋液最終沉淀物的量液越大，經(jīng)分析，陳醋液中殘留不同分子量物質(zhì)對(duì)陳醋的色度和感官評(píng)分影響不大，但殘留物中蛋白質(zhì)或多肽的平均疏水性與最終沉淀物的量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.895。

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