張江寧，王娟娟，張俊杰，楊春

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，太原 030031；2.山西大學(xué)，太原 030031)

紅曲是紅曲霉發(fā)酵制成的產(chǎn)品的總稱，國內(nèi)外大量研究表明由于紅曲含有洛伐他汀成分，因此具有明顯的降膽固醇和降血脂的功效，與傳統(tǒng)中成藥、魚油類、亞麻酸類相比，在治療效果上更勝一籌[1]，起效迅速，而且具有生產(chǎn)成本低、食用方便等優(yōu)點。但是紅曲霉發(fā)酵過程中產(chǎn)生的桔青霉素是對人體有害的真菌毒素[2]，靶器官為人體腎臟，具有致癌致畸作用，因此，紅曲產(chǎn)品中桔青霉素的含量問題引起了廣泛的關(guān)注[3]。國外一些國家早已將紅曲產(chǎn)品中的桔青霉素含量作為食品污染的嚴格控制指標(biāo)，這使我國紅曲產(chǎn)品的出口

受到了很大的限制，桔青霉素問題已成為我國紅曲產(chǎn)品出口的瓶頸[4]，如何通過工藝革新提高洛伐他汀、降低桔青霉素含量是亟待研究的課題[5]。本實驗建立了洛伐他汀、桔青霉素的高效液相色譜檢測方法，并在此基礎(chǔ)上研究6種不同發(fā)酵基質(zhì)對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響，旨在研究適合生產(chǎn)紅曲米的優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基，在實現(xiàn)紅曲保健功能作用的同時，避免毒副作用和不良反應(yīng)的發(fā)生，保證紅曲藥用和食用的安全性。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

安卡紅曲：實驗室保藏，甲醇、磷酸、95%乙醇洛伐他汀、桔青霉素、乙醇提取液(75%)、乙腈、磷酸、甲醇、甲苯、乙酸乙酯、甲酸、復(fù)合萃取劑(TEF)：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(7∶3∶1)，將7份體積的甲苯、3份體積的乙酸乙酯和1份體積的甲酸混合而成。

SW-CJ-2G 超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；GMSX-280高壓滅菌鍋 上海博迅有限公司；LG10-2.4離心機 北京醫(yī)用離心機廠；高效液相色譜儀：DIONEX UltiMate 3000 UHPLC+focused，配備泵RS Pump，自動進樣器RS Autosampler，柱溫箱RS Column Compartment，檢測器 Diode Array Detector；Thermo Scientific Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀； SHZ-D(III)不銹鋼循環(huán)水式真空泵 北京醫(yī)用離心機廠；JY92-ⅡN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試驗方法[6]

1.2.1 PDA瓊脂斜面培養(yǎng)基

稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛(煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可)，用4層紗布過濾，再加葡萄糖和瓊脂各20 g，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后加入檸檬酸1 g，再補足水分至1000 mL，分裝試管，加塞、包扎，121 ℃滅菌20 min后取出，試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆肹7]。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基及紅曲米制備[8]

原料20 g分別裝入250 mL三角瓶中，經(jīng)清洗，放置于0.25%的檸檬酸水用蒸鍋蒸熟，蒸至物料顆粒分散、微粘狀態(tài)，分別裝入250 mL三角瓶中，加自來水適量，包扎，121 ℃滅菌30 min。紅曲米制作：挑取1環(huán)保藏菌種接種于斜面培養(yǎng)基中，于 31 ℃恒溫箱中擴大培養(yǎng)1周，試管表面加無菌生理鹽水，稀釋制成孢子濃度約為106～107個/mL的懸液。以每瓶10 mL孢子懸液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)6天。每天翻曲，并根據(jù)情況加pH 4的檸檬酸水。

1.2.3 不同固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)紅曲米感官評價及對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響[9]

取大米、小米、黑小米、燕麥米、苦蕎麥仁、高粱20 g分別裝入250 mL三角瓶中，其余方法同1.2.2，制成紅曲米[10]，進行感官評價并測定洛伐他汀及桔青霉素含量[11,12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 洛伐他汀UHPLC測定方法的建立[13]

2.1.1 發(fā)酵樣品處理[14,15]

將發(fā)酵樣品碾磨烘干過40目篩，取0.5 g于50 mL比色管中，用70%乙醇溶液定容到50 mL，55 ℃水浴萃取1 h，每隔20 min震蕩1次，水浴結(jié)束后冷卻至室溫，取5 mL萃取液微濾。

2.1.2 UHPLC條件

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，流動相A為純水，流動相B為乙腈，流速0.200 mL/min，流動相梯度設(shè)置：0 min，5% B；1 min，5% B；8 min，95% B；15 min，95% B；15.01 min，5% B；18 min，5% B。柱溫：35 ℃，檢測波長238 nm，進樣量：2 μL。

2.1.3 標(biāo)準曲線的繪制及洛伐他汀標(biāo)準品及發(fā)酵樣品譜圖[16,17]

標(biāo)準曲線的配制：準確稱取0.002 g的洛伐他汀標(biāo)準品于100 mL容量瓶中，用色譜甲醇溶解并定容，制成20 mg/L的洛伐他汀標(biāo)準儲備液。取一定量的儲備液用甲醇稀釋后配制成質(zhì)量濃度10，5，2，1，0.5，0.1，0.05 mg/L的標(biāo)準工作液用于制標(biāo)準曲線。將標(biāo)準溶液注入液相色譜儀中，以保留時間結(jié)合其質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)定性，洛伐他汀標(biāo)準品與以小米為基質(zhì)功能紅曲的UHPLC-MS圖見圖1。根據(jù)標(biāo)品的保留時間可以判斷，洛伐他汀出峰時間為10 min，其質(zhì)譜精確分子量為427.24550，對應(yīng)為其分子的加鈉峰[M+Na]+。以洛伐他汀標(biāo)準品質(zhì)量濃度(mg/L)與相對應(yīng)的質(zhì)譜峰面積(Y)繪制標(biāo)準曲線見圖2，獲得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

圖1 洛伐他汀標(biāo)準品與以小米為基質(zhì)功能紅曲的UHPLC-MS圖Fig.1 UHPLC-MS spectrum of lovastatin standard sample and functional monascus with millet as substrate

圖2 洛伐他汀標(biāo)準曲線Fig.2 Standard curve of lovastatin

2.2 桔青霉素含量測定方法[18]

2.2.1 發(fā)酵樣品處理

用電子天平準確稱取一定量固態(tài)紅曲樣品6 g于100 mL具塞比色管中，加入40 mL TEF溶液，超聲提取10 min(強度40%，工作5 s，間隔5 s)3000 r/min離心20 min,上清液轉(zhuǎn)入250 mL具塞三角瓶中，殘渣用30 mL TEF溶液同上述步驟再提取2次，合并3次提取上清液于250 mL具塞三角瓶中，40 ℃真空濃縮至干后加入60 mL甲醇溶解，經(jīng)微孔有機濾膜過濾后進行HPLC分析。

2.2.2 UHPLC檢測條件

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)，流動相A為純水，流動相B為乙腈，流速0.200 mL/min，流動相梯度設(shè)置：0 min，5% B；1 min，5% B；8 min，95% B；15 min，95% B；15.01 min，5% B；18 min，5% B。柱溫：35 ℃，檢測波長:238 nm，進樣量：2 μL。

2.2.3 標(biāo)準曲線的繪制及桔青霉素標(biāo)準品及發(fā)酵樣品譜圖[19]

桔青霉素標(biāo)準溶液：準確稱取0.002 g的桔青霉素標(biāo)準品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成20 mg/L的桔青霉素標(biāo)準儲備液。取一定量的儲備液用甲醇稀釋2倍，制成10 mg/L的標(biāo)準工作液。儲備液和工作液密封后于4 ℃冰箱閉光保存，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。工作液從冰箱取出后室溫下放置10 min。將工作液用甲醇稀釋后配制成質(zhì)量濃度5，1，0.25，0.1 mg/L的標(biāo)準工作液用于制標(biāo)準曲線。分別將不同質(zhì)量濃度20，10，5，1，0.25，0.1 mg/L的桔青霉素標(biāo)準溶液注入液相色譜儀中，以保留時間結(jié)合其質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)定性，桔青霉素標(biāo)準品與以小米為基質(zhì)功能紅曲的UHPLC-MS譜圖見圖3。根據(jù)標(biāo)品的保留時間可以判斷，桔青霉素出峰時間為6.26 min，其質(zhì)譜精確分子量為251.09140，對應(yīng)其加氫形式[M+H]+。以桔青霉素質(zhì)量濃度與相對應(yīng)的峰面積繪制標(biāo)準曲線見圖4，獲得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，以此計算樣品中桔青霉素含量。

圖3 桔青霉素標(biāo)準品及以小米為基質(zhì)功能紅曲的UHPLC-MS圖Fig.3 UHPLC-MS spectrum of citrinin standard sample and functional monascus with millet as substrate

圖4 桔青霉素標(biāo)準曲線Fig.4 Standard curve of citrinin

2.3 不同發(fā)酵基質(zhì)紅曲米感官評價

發(fā)酵過程中，不同發(fā)酵基質(zhì)最終發(fā)酵產(chǎn)物特征見圖5[20-22]。

圖5 不同發(fā)酵基質(zhì)最終發(fā)酵產(chǎn)物特征Fig.5 The characteristics of final fermented products with different fermentation substrates

由圖5可知，以大米、小米為基質(zhì)發(fā)酵菌絲最先生長，原料最先變紅，發(fā)酵至6天時，紅曲大米表面顏色鮮紅，斷面為粉紅色，色澤鮮艷，具有紅曲固有的曲香；紅曲小米表面呈橙紅色，斷面為米紅色；黑小米發(fā)酵至8天時顏色呈黑紅色；苦蕎麥仁呈深紅色，斷面為粉紅色；高粱、燕麥米[23]菌絲生長最慢，發(fā)酵至3天時，原料開始顯現(xiàn)紅色，最終發(fā)酵至8天時，顏色不再變化，原料本身顏色與紅色相間，具有些許紅曲固有的曲香，說明原料發(fā)酵不充分，這可能是由于原料表面種皮較厚，粉碎程度不高導(dǎo)致淀粉物質(zhì)沒有被充分暴露出來，未能被充分利用，同時簡單的蒸煮方式導(dǎo)致淀粉熟化程度不夠，不利于紅曲菌種生長，造成原料利用不充分，因此以高粱、燕麥米為基質(zhì)發(fā)酵菌絲生長緩慢，原料利用率低。

2.4 不同發(fā)酵基質(zhì)對紅曲米洛伐他汀及桔青霉素含量的影響

不同發(fā)酵基質(zhì)對紅曲米洛伐他汀及桔青霉素含量的影響見表1。

表1 不同發(fā)酵基質(zhì)對紅曲米洛伐他汀及桔青霉素含量的影響Table 1 The effect of different fermentation substrates on the content of lovastatin and citrinin produced by monascus

不同發(fā)酵基質(zhì)對紅曲產(chǎn)洛伐他汀及桔青霉素的含量有重要影響[24]，單獨以大米為發(fā)酵基質(zhì)生產(chǎn)的功能性紅曲，其洛伐他汀含量最高，達到13.88 mg/g，小米、苦蕎麥仁、黑小米次之，燕麥米[25]、高粱較低；以苦蕎麥仁、小米為發(fā)酵基質(zhì)生產(chǎn)的功能性紅曲桔青霉素的含量最低，為1.2 mg/kg，燕麥米桔青霉素的含量最高，為3.6 mg/kg。傳統(tǒng)功能紅曲通常以大米為原料，但是發(fā)酵過程中大米容易粘結(jié)，影響菌絲的生長，該實驗表明小米、苦蕎麥仁由于其顆粒度小，且在發(fā)酵過程中不易結(jié)團，分散性好，可以為微生物生長提供較好的生長面積，而且桔青霉素含量較低[26]，可以作為很好的發(fā)酵基質(zhì)，高粱、燕麥米有較厚的種皮，紅曲菌生長困難，經(jīng)粉碎處理后菌絲生長旺盛，洛伐他汀含量略有提高，但在發(fā)酵過程中需要不斷地補充水分，而且燕麥紅曲米的桔青霉素含量較高，這可能是由于原料中某種成分促進了桔青霉素的生成，因此確定將小米作為發(fā)酵基質(zhì)可以滿足高洛伐他汀低桔青霉素的要求。

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