李生茂 劉 琳 潘 媛 敖 慧* 唐友愛

1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院藥物研究，四川 南充 637000； 3. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川 南充 637000；4.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137

川芎為傘形科藁本屬多年生草本植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，中醫(yī)認(rèn)為其性溫，味辛，歸肝、膽、心包經(jīng)，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效[1-3]。現(xiàn)代研究顯示[4-11]，揮發(fā)油是川芎主要的活性物質(zhì)之一，其含有苯酞類、烯萜醇及脂肪酸類等類化學(xué)成分，具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解痙、改善血液流變、降血壓、抗缺血再灌注損傷及抗氧化等多種藥理作用。其中，抗氧化是川芎揮發(fā)油重要的活性之一，與其體內(nèi)對(duì)抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦缺血再灌注損傷的作用關(guān)系密切[11-12]，但目前有關(guān)川芎揮發(fā)油的研究，多集中在不同提取方法基礎(chǔ)上的化學(xué)成分比較，或單純的藥效評(píng)價(jià)，而關(guān)于其體外抗氧化活性的研究報(bào)道較少?；诖?，本實(shí)驗(yàn)在水蒸氣蒸餾法獲得川芎揮發(fā)油的基礎(chǔ)上，采用GC-MS分析其化學(xué)成分，并采用DPPH、ABTS法觀察其抗氧化活性，以期為川芎揮發(fā)油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 川芎藥材購(gòu)于成都五塊石中藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)陳璐副教授鑒定為川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖。正己烷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：T20100928)；無水硫酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140114)；1，1-二苯基苦基苯肼(sigma公司，批號(hào)：034K1071)， 蘆丁(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：130824)；2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(aladdin 公司，批號(hào)：L1619007)；過硫酸鉀(aladdin公司，批號(hào)：A1719017)，甲醇(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：201309230)，水為蒸餾水(自制)。1.2 儀器 Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)；Agilent GC-MSD工作站(美國(guó)安捷倫公司)；Ohaus Discovery十萬分之一電子分析天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；Epoch 微孔板分光光度計(jì)(美國(guó)BIOTEK 公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 川芎揮發(fā)油的制備 取川芎藥材粉碎，過20目篩，稱取粗粉約200g，置2000mL圓底燒瓶中，加入1200mL蒸餾水，按《中國(guó)藥典》2015年版一部揮發(fā)油測(cè)定法進(jìn)行，水蒸汽蒸餾5h，得川芎揮發(fā)油約0.71mL。

2.2 GC-MS 分析

2.2.1 分析條件 GC條件：載氣為氦氣；體積流量1.0mL/min；程序升溫，初始溫度50℃，保持2min；10℃/min速率升至120℃，保持8min；5℃/min速率升至180℃，保持8min；20℃/min速率升至260℃，保持4min，分流進(jìn)樣，分流比：1∶60；進(jìn)樣量1μL；進(jìn)樣口溫度280℃。

MS條件：EI電離；電子能量70 eV；離子源溫度220℃；全掃描方式。

2.2.2 樣品測(cè)定 取“2.1”項(xiàng)下制備樣品，加正己烷稀釋，用無水硫酸鈉除去水分，0.45μm微孔濾膜過濾，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定川芎揮發(fā)油的總離子流圖，并通過NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[13-16]，確定各色譜峰代表的化學(xué)成分。川芎揮發(fā)油中共檢出73個(gè)色譜峰，鑒定了其中的33個(gè)色譜峰，其峰面積之和占總峰面積的85.15%，其中烷烴類成分占0.52%，烯烴類成分占9.62%，酚類成分占2.21%，醇類成分占5.33%，醛酮類成分占1.89%，酯類成分占65.04%(其中內(nèi)酯類成分為63.31%)。結(jié)果見表1，圖1。

表1 川芎揮發(fā)油化學(xué)成分及相對(duì)含量

續(xù)表

表1 川芎揮發(fā)油化學(xué)成分及相對(duì)含量

續(xù)表

表1 川芎揮發(fā)油化學(xué)成分及相對(duì)含量

2.3 體外抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 清除DPPH自由基 參照文獻(xiàn)方法[17-18]并略做修改，稱取適量DPPH加甲醇配制成濃度為170μmol/L的溶液，避光保存。取川芎揮發(fā)油樣品或蘆丁適量，加甲醇溶解并配制成一定濃度的供試品溶液。取0.15 mL供試品溶液與0.15mL DPPH溶液置96孔板，混勻后室溫避光放置60 min，517nm處測(cè)定吸收度A1；同時(shí)測(cè)定0.15 mL供試品溶液+0.15 mL甲醇的吸收度A0，0.15 mL甲醇+0.15 mL DPPH溶液的吸收度A2，按公式計(jì)算清除率：DPPH自由基清除率=[1-(A1-A0)]/A2×100%。以清除率(Y)對(duì)藥物濃度(X)進(jìn)行回歸，根據(jù)對(duì)數(shù)函數(shù)方程求出清除率為50%時(shí)藥物的濃度(IC50)，川芎揮發(fā)油清除DPPH自由基的IC50為0.2325mg/mL。同法測(cè)定陽(yáng)性對(duì)照蘆丁的IC50值為3.8888μg/mL，結(jié)果見圖2，圖3。

2.3.2 清除ABTS自由基 參照文獻(xiàn)方法[17-18]并略做修改， 將10 mL 2 mM ABTS水溶液與100 μL 70 mM過硫酸鉀溶液混合，室溫避光放置12 h，得ABTS儲(chǔ)備液。使用前用甲醇稀釋成工作液，使在734nm波長(zhǎng)下的吸光度為(0.70±0.05)。取川芎揮發(fā)油樣品適量，加甲醇溶解并配制成一定濃度的供試品溶液。測(cè)定時(shí)，取0.045mL供試品溶液+0.155mL ABTS溶液置96孔板，混勻后室溫避光放置20min，734nm處測(cè)定吸收度A1；同時(shí)測(cè)定0.045mL供試品+0.155mL甲醇的吸收度A0和0.045mL甲醇+0.155mL ABTS溶液的吸收度A2，按公式計(jì)算清除率：ABTS自由基清除率=[1-(A1-A0)]/A2×100%。以清除率(Y)對(duì)藥物濃度(X)進(jìn)行回歸，根據(jù)對(duì)數(shù)函數(shù)方程求出清除率為50%時(shí)藥物的濃度(IC50)，川芎揮發(fā)油清除ABTS自由基的IC50為0.1763mg/mL，同法測(cè)定陽(yáng)性對(duì)照蘆丁的IC50值為5.1618μg/mL，結(jié)果見圖2，圖3。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油，并采用GC-MS對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析，共檢測(cè)出73個(gè)色譜峰，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索鑒定了其中33個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，所鑒定的化合物色譜峰峰面積之和占總峰面積的85.15%，可以較好地代表川芎揮發(fā)油的化學(xué)成分特征。而從已鑒定的化合物結(jié)構(gòu)類型來看，川芎揮發(fā)油中含量最高的是以Z-藁本內(nèi)酯(46.17%)為代表的酯類化學(xué)成分，占總峰面積的65.04%(其中內(nèi)酯類成分為63.31%)，其它類成分含量高低依次為烯烴類、醇類、酚類、醛酮類和烷烴類化學(xué)成分。

DPPH自由基法、ABTS自由基法是目前常用的研究藥物對(duì)自由基清除作用的方法之一[19-20]。筆者結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]，在前期研究基礎(chǔ)上，采用基于96孔板結(jié)合酶標(biāo)儀檢測(cè)的方法對(duì)川芎揮發(fā)油清除DPPH自由基、ABTS自由基的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，與常用的基于紫外分光光度計(jì)測(cè)定的清除自由基活性方法比較[11]，具有操作簡(jiǎn)便，節(jié)省試劑和樣品，并可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果顯示，川芎揮發(fā)油在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，均具有不同程度的清除DPPH自由基、ABTS自由基的活性，并具有較好的量效依賴關(guān)系，但其對(duì)兩種自由基的清除活性均小于陽(yáng)性對(duì)照蘆丁。

實(shí)驗(yàn)在采用GC-MS分析川芎揮發(fā)油化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，僅觀察了其體外清除DPPH自由基、ABTS自由基的活性，而川芎揮發(fā)油對(duì)其它自由基有無清除作用及其抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為川芎揮發(fā)油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的參考。

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