鄭文倩 孫毅 高露娟 鄔清芝 李明 曾同祥

434100湖北荊州，長江大學(xué)（鄭文倩）；長江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市中心醫(yī)院皮膚科（孫毅、鄔清芝、曾同祥）；復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科（高露娟、李明）

皮炎外瓶霉是暗色絲孢霉病的常見致病菌之一［1］，可引起皮膚、皮下組織感染，偶可致系統(tǒng)性播散性感染，在亞洲人群以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染多見，死亡率高達(dá)90%［2-3］。生物膜形成不僅是侵襲性感染發(fā)展的先決條件，同時也與80%的非急性感染相關(guān)［4］。與游離態(tài)真菌相比，生物膜對多數(shù)抗真菌藥物耐藥，是臨床療效欠佳的潛在原因［4］。為了評估皮炎外瓶霉生物膜的抗真菌藥物敏感性，開發(fā)可能的藥物聯(lián)合方案，我們用96孔板構(gòu)建皮炎外瓶霉生物膜，以棋盤式微量液基稀釋法評估抗真菌藥物單用及聯(lián)合抗皮炎外瓶霉生物膜的效果。

一、材料和方法

1.實驗菌株：皮炎外瓶霉菌株5株，質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌（ATCC22019），所有菌株均于實驗前用沙氏培養(yǎng)基活化1周，以保證受試真菌的活力與純度。所有皮炎外瓶霉菌株均分離自臨床患者，并經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定。

2.抗真菌藥：伊曲康唑（批號84625-61-6，純度＞99%）、伏立康唑（批號137234-62-9，純度＞99%）、兩性霉素B（批號1397-89-3，純度 ＞80%）和卡泊芬凈（批號179463-17-3，純度＞97%）均由美國Sigma公司生產(chǎn)。使用分析純二甲基亞砜將藥物溶解成儲存液，濃度均為1 600mg/L。

3.構(gòu)建皮炎外瓶霉生物膜：通過改良的96孔板法構(gòu)建皮炎外瓶霉生物膜［5-6］。從沙氏培養(yǎng)基上收集孢子，用20ml RPMI1640培養(yǎng)基重懸，并調(diào)至1×107/m l菌懸液；在96孔板加入200μl上述孢子懸浮液，于37℃培養(yǎng)72 h；去上層培養(yǎng)基，避免破壞底部生物膜。磷酸鹽緩沖液清洗3次。

4.體外單藥藥物敏感性測試：參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical Laboratory Standard Institute，CLSI）頒布的M38-A2方案［7］，制備抗真菌藥物溶液，伊曲康唑、伏立康唑和卡泊芬凈終濃度為0.25～32mg/L，兩性霉素B終濃度為0.125～8mg/L。倍比稀釋后，將受試藥物加入96孔板，每孔加入100μl，同時設(shè)立陽性對照（無藥孔區(qū)）和陰性對照（無菌孔區(qū)），37℃孵育72 h。每孔加入100μl3，3′-［1-（苯氨?；?3，4-四氮唑］-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸鈉（XTT）/甲萘醌混合溶液，孵育4 h后，于每孔中取80μl上清液，轉(zhuǎn)移到新的96孔板，并在490 nm處讀取吸光度（A值）［8］。所有實驗均重復(fù)3次。生物膜最低抑菌濃度（SMIC）50和SMIC80定義為：與對照組相比，其A值減少50%或80%的抗真菌藥物濃度［7］。

5.體外聯(lián)合藥物敏感性測試：采用棋盤法［8］。在含有生物膜的96孔板中分別加入不同的兩種藥物，自左向右1～8列為聯(lián)合區(qū)，每孔加入2倍終濃度藥物倍比稀釋液各50μl；第9、10列為單獨用藥區(qū)，藥物終濃度梯度同聯(lián)合區(qū)，同時設(shè)立陽性對照（無藥孔區(qū)）和陰性對照（無菌孔區(qū)），35℃孵育72 h。每孔加入100μl XTT/甲萘醌混合溶液，孵育4 h，每孔取80μl上清液，轉(zhuǎn)移到另1個96孔板，并在490 nm處讀取A值［9］。所有實驗均重復(fù)3次。藥物聯(lián)合效應(yīng)根據(jù)分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）評判，F(xiàn)ICI=SMICA聯(lián)合/SMICA單獨+SMICB聯(lián)合/SMIC B單獨［9］。FICl＜ 0.5為協(xié)同作用，0.5＜FICI≤4為無關(guān)，F(xiàn)ICI＞4為拮抗作用［10］。

二、結(jié)果

1.抗真菌藥單用抗皮炎外瓶霉生物膜效應(yīng)：伊曲康唑、伏立康唑和卡泊芬凈對皮炎外瓶霉生物膜的SMIC50和SMIC80范圍均＞32mg/L；兩性霉素B的SMIC50為1～2mg/L，SMIC80為4～8mg/L。見表1。

2.抗真菌藥聯(lián)合抗皮炎外瓶霉生物膜效應(yīng)：伏立康唑與兩性霉素B聯(lián)合時，兩者SMIC80范圍分別降低至0.5～1mg/L和0.25～0.5mg/L，表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。兩性霉素B與伊曲康唑、兩性霉素B與卡泊芬凈、伏立康唑與卡泊芬凈聯(lián)合時均未觀察到協(xié)同效應(yīng)。所有聯(lián)合用藥組均未觀察到拮抗作用。見表1。

三、討論

我們用改良的96孔板法構(gòu)建皮炎外瓶霉生物膜體外模型，進(jìn)行抗真菌藥物敏感性測試。由于皮炎外瓶霉生長緩慢，在制備過程中，我們將菌懸液調(diào)至1×107/ml，孵育時間延長到72 h；生物膜藥物敏感性測試的孵育時間與參考方案相比也延長至48 h［5-6，8］。研究顯示，抗真菌藥物單藥作用于皮炎外瓶霉生物膜時，兩性霉素B的SMIC50濃度范圍為1～2mg/L，相對其他藥物具有較好的抗皮炎外瓶霉生物膜活性。既往研究顯示，伏立康唑、伊曲康唑和兩性霉素B對皮炎外瓶霉游離態(tài)均有較好的抗真菌效應(yīng)［4］，但本研究發(fā)現(xiàn)，伏立康唑、伊曲康唑和卡泊芬凈對皮炎外瓶霉生物膜的SMIC50及SMIC80范圍均較高，證實抗真菌藥物對生物膜態(tài)的活性明顯低于對游離態(tài)的活性［11］。體外聯(lián)合藥物敏感試驗顯示，兩性霉素B與伏立康唑聯(lián)合對皮炎外瓶霉生物膜具有協(xié)同效應(yīng)，既往有此聯(lián)合方案成功治愈系統(tǒng)性皮炎外瓶霉感染的報道［12］。此外，既往研究顯示，卡泊芬凈與兩性霉素B或伏立康唑聯(lián)合分別對62.5%和93.8%的游離態(tài)皮炎外瓶霉具有協(xié)同效應(yīng)［7］，但本研究發(fā)現(xiàn)，這兩個組合方案以及兩性霉素B與伊曲康唑組合對皮炎外瓶霉生物膜均無協(xié)同作用，體現(xiàn)了生物膜態(tài)和游離態(tài)對聯(lián)合藥物敏感性的差異，提示我們應(yīng)積極探索針對生物膜的新型治療方案。

綜上所述，與伏立康唑、伊曲康唑和卡泊芬凈相比，兩性霉素B具有更強的抗皮炎外瓶霉生物膜作用，兩性霉素B和伏立康唑聯(lián)合能夠增強抗皮炎外瓶霉生物膜的作用，為難治性皮炎外瓶霉相關(guān)感染的治療方案提供理論基礎(chǔ)。本研究為體外實驗，將來還需要更多研究來證實該聯(lián)合方案的體內(nèi)效應(yīng)。

表1 4種抗真菌藥單用及聯(lián)合體外抗皮炎外瓶霉生物膜50%與80%最低抑菌濃度（SMIC50、SMIC80） mg/L

志謝北京大學(xué)第一醫(yī)院李若瑜教授和劉偉教授提供皮炎外瓶霉臨床菌株

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