曾榮 童建波 劉宇甄 陳青 段志敏 劉彩霞 呂桂霞 林彤 李岷

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所激光科 江蘇省皮膚性病學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（曾榮、劉宇甄、林彤），真菌科（童建波、段志敏、劉彩霞、呂桂霞、李岷）；江蘇省血液中心（陳青）

煙曲霉是系統(tǒng)性曲霉病常見的致病菌［1］，極性生長(zhǎng)在其致病性中發(fā)揮重要作用。近年發(fā)現(xiàn)，鈣信號(hào)系統(tǒng)不僅參與真菌生長(zhǎng)、發(fā)育調(diào)控，同時(shí)在調(diào)控真菌菌絲的極性生長(zhǎng)方面也有作用［2-3］。鈣調(diào)蛋白（CaM）是該通路的核心成分［4］，對(duì)其進(jìn)行研究將有助于了解鈣信號(hào)系統(tǒng)。CaM基因在煙曲霉中是一個(gè)必需基因，無(wú)法直接敲除該基因進(jìn)行相關(guān)研究［5］，但可通過基因重組、添加標(biāo)記基因并表達(dá)標(biāo)記蛋白來進(jìn)行研究。我們擬對(duì)煙曲霉CaM進(jìn)行紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）標(biāo)記，構(gòu)建CaMRFP煙曲霉菌株，觀察該合成菌株菌絲極性生長(zhǎng)過程中CaM動(dòng)態(tài)分布，以期了解CaM在煙曲霉致病及耐藥方面的作用。

材料與方法

一、材料

1.菌株和質(zhì)粒：煙曲霉菌株A1160（△Ku80；pyrG）作為煙曲霉轉(zhuǎn)化受體菌株來自美國(guó)真菌保藏中心，具有尿苷、尿嘧啶缺陷及nku基因缺失的特點(diǎn)。質(zhì)粒pXDRFP4同樣來自美國(guó)真菌保藏中心（ATCC），質(zhì)粒圖譜見圖1。

2.主要試劑和儀器：自配YAG培養(yǎng)液，每升含酵母粉5 g、葡萄糖20 g、微量元素1m l，固體培養(yǎng)基需加入20 g/L瓊脂粉；在YAG基礎(chǔ)上加入1.1 g/L尿苷及1.2 g/L尿嘧啶制備YUU培養(yǎng)基；在YUU培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入44.7 g/L氯化鉀制備YUUK培養(yǎng)基；RPMI 1640液體培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）。rTaq聚合酶（日本TaKaRa公司），AccuPrime Taq High Fidelity DNA聚合酶（美國(guó)Invitrogen公司），PTC-100TMPCR儀（美國(guó)MJResearch公司）。

3.引物設(shè)計(jì)：構(gòu)建含有紅色熒光蛋白-煙曲霉pyrG營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記（mRFP-AfpyrG）的轉(zhuǎn)化子片段，對(duì)煙曲霉CaM基因序列的前后兩端側(cè)翼序列及含有mRFP-AfpyrG營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。融合PCR產(chǎn)物線性片段包括3部分，分別為上游組蛋白H1側(cè)翼序列部分，mRFP-AfpyrG質(zhì)粒部分，下游組蛋白染色體側(cè)翼序列部分，見圖2。先對(duì)上述3個(gè)片段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)9條引物（包括P1～P6），見表1。上游側(cè)翼序列使用P1、P3擴(kuò)增，下游側(cè)翼序列使用P4、P6擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物時(shí)在P3、P4引物上添加Cassette序列作為接頭。

圖1 pXDRFP4質(zhì)粒圖譜 紅色為紅色熒光蛋白（RFP）序列，藍(lán)色為AfpyrG營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記

圖2 鈣調(diào)蛋白-紅色熒光蛋白（CaM-RFP）煙曲霉菌株構(gòu)建原理圖 綠色和黑色均為所要替換基因組序列兩邊的側(cè)翼序列，紅色和藍(lán)色序列為pXDRFP4質(zhì)粒上Cassette片段，紅色為RFP序列，藍(lán)色為AfpyrG營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記

表1 引物序列

二、方法

1.轉(zhuǎn)化子線性片段合成：擴(kuò)增各組成片段［6］，①上游側(cè)翼序列（L-flank），PCR步驟：95℃ 2min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，10℃延伸1 h。PCR反應(yīng)體系由100 ng模板DNA、300 nmol/L引物和1.25 U AccuPrime Pfx DNA聚合酶等組成；②下游側(cè)翼序列（R-flank），擴(kuò)增步驟：94 ℃ 3min，94 ℃ 45 s，49℃30 s，72 ℃ 1min（5個(gè)循環(huán)），94℃ 45 s，54℃ 1min，72℃ 1min（30個(gè)循環(huán)），72℃10min，10℃延伸。PCR反應(yīng)體系由100 ng模板DNA、300 nmol/L引物、5 U rTaq DNA聚合酶等組成；③Cassette上RFP-AfpyrG片段PCR步驟：94℃2min，94 ℃ 20 s，70 ℃1 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 3min，共30個(gè)循環(huán)，10℃延伸。PCR反應(yīng)體系由100 ng模板DNA、300 nmol/L引物、5 U rTaq DNA聚合酶等組成。PCR產(chǎn)物均用Takara切膠回收試劑盒純化，凍于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

3個(gè)片段連接融合PCR：用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化用的線性片段。反應(yīng)體系：模板（共3部分，即2個(gè)側(cè)翼序列和Cassette片段，每部分0.5μl），P2和P5引物（每種終濃度 400 nmol/L），2.5 U AccuPrime Taq High Fidelity DNA聚合酶，緩沖液20μl。PCR步驟：94 ℃2min，94 ℃20 s，70℃ 1 s，55℃ 30 s，68 ℃4min，9個(gè)循環(huán)；94 ℃ 20 s，70 ℃ 1 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 5min，4個(gè)循環(huán)；94 ℃20 s，70 ℃ 1 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 5min，9個(gè)循環(huán)，10℃延伸。切膠回收目的片段，以fusion產(chǎn)物片段為模板，用AccuPrime Pfx DNA聚合酶再次擴(kuò)增，然后切膠回收目的片段，以獲得足量轉(zhuǎn)化用片段。

2.煙曲霉原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化：采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將整合的融合PCR片段轉(zhuǎn)入受體菌株A1160（△Ku80；pyrG）中。按照文獻(xiàn)配制轉(zhuǎn)化液，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的制備及篩選［6］，操作過程如下：收集在YUU固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2.5 d的A1160菌株的孢子，將孢子以5×108個(gè)/m l加入YUUK液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。鏡檢，待50%以上孢子萌發(fā)時(shí)，收集孢子，將孢子重懸于原生質(zhì)體溶液。鏡檢，待絕大多數(shù)孢子都已經(jīng)形成原生質(zhì)體，離心收集。在原生質(zhì)體懸液中加入質(zhì)粒DNA，先后經(jīng)歷冰浴和熱激。再向原生質(zhì)體懸液中加入YAGK（2%瓊脂粉），倒入無(wú)菌平板下過夜。3 d后觀察，轉(zhuǎn)化子計(jì)數(shù)，并篩選轉(zhuǎn)化子。

3.轉(zhuǎn)化子初步篩選：將含1%瓊脂糖的固體培養(yǎng)基液化，吸取50μl，在無(wú)菌載玻片上均勻涂一薄層，待冷卻凝固后用牙簽將所有的轉(zhuǎn)化子分別接種于YAG培養(yǎng)基上，并同步點(diǎn)接在涂有一層YAG瓊脂糖培養(yǎng)基的載玻片上，轉(zhuǎn)化子號(hào)一一對(duì)應(yīng)，放于濕盒中37℃培養(yǎng)14 h后，用熒光顯微鏡觀察，采用DsRed通道，發(fā)現(xiàn)菌株有明顯熒光后，從YAG平板上挑出對(duì)應(yīng)號(hào)碼菌株在YAG培養(yǎng)基上劃線分離單菌落，培養(yǎng)2 d，再取單菌落于YAG培養(yǎng)基上劃線分離，并同步點(diǎn)接在涂有一層YAG培養(yǎng)基的載玻片上，菌株號(hào)一一對(duì)應(yīng)，以保證每次所挑菌落都有熒光，重復(fù)3次取均值以保證菌落的純度以及熒光表型的穩(wěn)定性，選取生長(zhǎng)最為旺盛、熒光表型最穩(wěn)定的1株菌，命名為CaM-RFP煙曲霉菌株。

4.轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證：使用引物CaM-RFP-P1和RFP-pyrG（R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)組蛋白H1側(cè)翼序列部分和mRFP-AfpyrG質(zhì)粒部分是否正確整合，PCR步驟：95 ℃ 2min，95 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 1min，共30個(gè)循環(huán)，10℃延伸，反應(yīng)體系由100 ng模板DNA、300 nmol/L引物、1.25 U AccuPrime Pfx DNA聚合酶等組成。用引物CaM-RFP-P6和F-RFP-pyrG進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)mRFP-AfpyrG質(zhì)粒部分與下游組蛋白染色體側(cè)翼序列部分是否正確整合，PCR步驟：95 ℃ 2min，95 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 1min，共30個(gè)循環(huán)，10℃延伸，反應(yīng)體系同上。野生菌株也使用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。

5.生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及形態(tài)學(xué)分析：野生菌株煙曲霉A1160和標(biāo)記菌株CaM-RFP煙曲霉在YAG固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)72 h后，挑取單菌落，研磨，用RPMI 1640液體培養(yǎng)基將菌懸液調(diào)至1.0×105/ml，置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)［7-8］。分別在4、8、10、16、24、48及72 h時(shí)使用0.5 g/L四甲基氮鹽（XTT）試劑檢測(cè)菌株生長(zhǎng)活力，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（A值）。同時(shí)將上述菌懸液置于預(yù)先放置細(xì)胞爬片的24孔板中培養(yǎng)。分別在4、8、10、16、24 h使用熒光顯微鏡觀察孢子出芽、菌絲形態(tài)及長(zhǎng)度等。每個(gè)結(jié)果至少重復(fù)3次取均值。

6.熒光顯微鏡觀測(cè)：使用蔡司顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）觀察菌絲熒光表達(dá)，開啟DsRed通道后先使用10×低倍鏡找熒光位置，后使用40×高倍鏡定位。

7.CaM在煙曲霉生長(zhǎng)過程中的動(dòng)態(tài)分布觀察：將孢子點(diǎn)種在培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)，在孢子接種后6 h開始每隔1 h采用顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察。孢子經(jīng)過培養(yǎng)可以在固體培養(yǎng)基上方形成小菌落，通過觀察長(zhǎng)在邊緣的菌絲觀察熒光表型。

三、統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證結(jié)果

使用引物CaM-RFP-P1和RFP-pyrG（R）可以自CaM-RFP煙曲霉菌株中擴(kuò)增出1條與預(yù)期大小一致、長(zhǎng)度為4 368 bp的DNA片段，而野生株無(wú)法擴(kuò)增出DNA片段。使用引物CaM-RFP-P6和F-RFP-pyrG可以自CaM-RFP煙曲霉菌株中擴(kuò)增出1條與預(yù)期大小一致、長(zhǎng)度為2 278 bp的DNA片段，而野生株無(wú)法擴(kuò)增出DNA片段。證明CaM-RFP煙曲霉菌株已經(jīng)發(fā)生了同源整合，CaM的C端RFP熒光蛋白標(biāo)記成功。見圖3。

二、CaM-RFP煙曲霉菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及形態(tài)學(xué)特征

圖3 重組株煙曲霉PCR驗(yàn)證結(jié)果 M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1、2：重組煙曲霉菌株；3、4：A1160野生煙曲霉菌株；1、3使用引物CaM-RFPP1/RFP-pyrG（R）擴(kuò)增；2、4使用引物CaM-RFP-P6/F-RFP+pyrG擴(kuò)增

圖4 野生株與重組株煙曲霉生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)比較 WT代表煙曲霉野生株；RFP-CaM代表紅色熒光蛋白標(biāo)記鈣調(diào)蛋白的煙曲霉重組株

圖5 鈣調(diào)蛋白在煙曲霉孢子出芽（5A）、菌絲伸長(zhǎng)（5B）、極性生長(zhǎng)（5C）和分支（5D～5F）形成過程中的動(dòng)態(tài)定位 5A～5F：分別代表培養(yǎng)6、7、8、9、10和11 h。箭頭示鈣調(diào)蛋白定位方向

在4、8、10、16、24、48、72 h時(shí)重組株和野生株煙曲霉間活力值（A490）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為2.16、0.865、2.83、4.51、1.32、3.29、1.96，均P＞0.05）。見圖4。煙曲霉孢子的生長(zhǎng)特性見圖5。8 h時(shí)重組株和野生株出芽率分別為8.92%±1.51%和8.75%±1.42%，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.553，P＞0.05）。8 h時(shí)重組株和野生株菌絲長(zhǎng)度分別為（64.92±7.61）μm和（63.54±8.17）μm，10 h時(shí)為（177.23±7.43）μm和（176.47±9.79）μm，兩時(shí)間點(diǎn)兩菌株間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為2.55、3.75，均P＞0.05）。16 h后，菌絲相互纏繞，長(zhǎng)度無(wú)法測(cè)量，但2株菌的生長(zhǎng)形態(tài)無(wú)顯著差異。

三、CaM在煙曲霉生長(zhǎng)過程中的動(dòng)態(tài)分布

見圖5。在固體培養(yǎng)基上接種孢子后6 h，CaM定位于孢子的一側(cè)，培養(yǎng)7～8 h后CaM所定位的位點(diǎn)分生出菌絲，9～10 h后分生出菌絲分支，形成新的生長(zhǎng)極。繼續(xù)培養(yǎng)，CaM一直位于生長(zhǎng)菌絲的頂端。

討 論

RFP標(biāo)記技術(shù)是研究蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位的最新方法。要實(shí)現(xiàn)該技術(shù)需通過分子克隆技術(shù)將目的基因與RFP基因融合，在活細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，融合蛋白上的RFP即可顯示目的蛋白的分布，無(wú)需任何外加的酶或底物即可方便地動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞。目前該技術(shù)廣泛用于研究細(xì)菌在宿主中的動(dòng)態(tài)定位等［8-9］，但煙曲霉領(lǐng)域的研究剛起步。我們構(gòu)建CaMRFP煙曲霉菌株來觀察CaM在煙曲霉極性生長(zhǎng)過程中的動(dòng)態(tài)定位情況，為開展煙曲霉基礎(chǔ)及應(yīng)用研究提供良好的材料。

我們利用融合PCR方法成功進(jìn)行CaM的C端RFP熒光蛋白標(biāo)記，并對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選和鑒定。融合PCR可便捷地進(jìn)行C端熒光蛋白標(biāo)記，其中引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。將3個(gè)片段連接的融合PCR效率不高，非特異性條帶較多，可進(jìn)一步純化；純化后得到的產(chǎn)物量不夠時(shí)，可以此為模板進(jìn)行再次擴(kuò)增，以得到足夠的轉(zhuǎn)化片段。

菌絲的極性生長(zhǎng)是煙曲霉致病能力的表現(xiàn)，具有極性生長(zhǎng)表現(xiàn)的細(xì)胞能夠承受強(qiáng)大的外力從而穿透其生長(zhǎng)介質(zhì)。我們前期［7］研究也發(fā)現(xiàn)，極性生長(zhǎng)能促進(jìn)煙曲霉生物膜的形成。Brand等［10］發(fā)現(xiàn)，白念珠菌鈣信號(hào)系統(tǒng)能夠使其從酵母狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫z狀態(tài)，即進(jìn)入極性生長(zhǎng)模式，該生長(zhǎng)模式會(huì)增加其對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲性。這一現(xiàn)象在其他類似研究中得到進(jìn)一步證實(shí)［11-12］。我們?cè)诓患尤魏蚊负偷孜锏那闆r下動(dòng)態(tài)觀察CaM熒光，發(fā)現(xiàn)在孢子出芽階段，紅色熒光主要聚集在出芽的一端。隨著菌絲的延長(zhǎng)，紅色熒光仍然處于菌絲的生長(zhǎng)頂端。當(dāng)部分熒光集中定位于除菌絲頂端外的點(diǎn)時(shí)，意味著新的分枝在該定位點(diǎn)將出現(xiàn)。表明CaM在一定程度上調(diào)控了孢子的萌發(fā)及菌絲的生長(zhǎng)方向。

總之，我們成功構(gòu)建CaM-RFP煙曲霉菌株。對(duì)該菌株生長(zhǎng)發(fā)育階段CaM分布的動(dòng)態(tài)觀察揭示了CaM參與調(diào)控?zé)熐规咦映鲅亢蜆O性生長(zhǎng)等生物學(xué)過程的功能，為進(jìn)一步探索CaM在煙曲霉對(duì)宿主侵襲過程中的動(dòng)態(tài)變化情況及可能的抗真菌藥物靶點(diǎn)提供依據(jù)。

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