甄昱 李珊山

130021長(zhǎng)春，吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科

研究顯示，白癜風(fēng)是以功能性黑素細(xì)胞減少為主要特征的一種自身免疫性疾病，以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫在白癜風(fēng)發(fā)生發(fā)展中起重要作用［1］。其中CD8+T細(xì)胞對(duì)黑素細(xì)胞的損傷作用已獲得共識(shí)，而CD4+T細(xì)胞的改變則相對(duì)比較復(fù)雜，關(guān)于白癜風(fēng)Th17以及Treg亞群的變化，目前尚存在爭(zhēng)議。為了解進(jìn)展期NSV患者外周血中CD4+T細(xì)胞各個(gè)亞群的變化，我們對(duì)進(jìn)展期非節(jié)段型白癜風(fēng)（NSV）患者CD4+T細(xì)胞亞群特異性表面標(biāo)志及其相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測(cè)，旨在探討白癜風(fēng)發(fā)生早期外周血CD4+T細(xì)胞的免疫狀態(tài)，以期為臨床免疫抑制治療提供合理依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

進(jìn)展期NSV組30例，男女各15例，年齡18～45歲，平均28.6歲；就診前2個(gè)月內(nèi)均未接受糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等藥物治療。健康對(duì)照組（取自健康志愿者）30例，男女各15例，年齡17～43歲，平均26.1歲。本研究通過吉林大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選者均簽署知情同意書。

二、主要試劑和儀器

人Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。淋巴細(xì)胞活化試劑盒、FACS calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司。細(xì)胞內(nèi)染色試劑盒、抗人CD4-FITC單抗、抗人干擾素（IFN）-γ-PECy5單抗、抗人IL-4-PE單抗、抗人IL-17A-APC單抗、抗人CD25-PE單抗及抗人CD127-APC單抗、人IFN-γ、IL-4、IL-17A、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）β1均購(gòu)于美國(guó)eBiboscience公司。酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

三、方法

1.樣本采集：NSV患者及健康對(duì)照外周血各5m l，經(jīng)抗凝處理后，F(xiàn)icoll密度梯度離心法收集外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）；5 ml外周血不經(jīng)抗凝處理，按常規(guī)方法收集血清后，分裝入1.5ml微量離心管內(nèi)，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.細(xì)胞表面染色：2×106PBMC（4× 105/管）加入CD4，CD25，CD127流式熒光抗體進(jìn)行表面染色，4℃孵育 30 min，用0.1%BSA PBS離心洗滌后，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)和Flowjo軟件分析。

3.淋巴細(xì)胞體外活化培養(yǎng)：5×106PBMC用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度，4×105/孔加入96孔板內(nèi)培養(yǎng)，同時(shí)在孔內(nèi)加入稀釋后的淋巴細(xì)胞活化試劑，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞表面CD4染色。

4.細(xì)胞因子染色：將已完成表面分子染色的細(xì)胞用0.1%BSA PBS離心洗滌后，每管加入300μl eBioscience的細(xì)胞內(nèi)染色試劑盒內(nèi)固定破膜打孔液處理細(xì)胞，室溫作用30min，破膜打孔液離心洗滌1次，然后用打孔液稀釋的細(xì)胞因子抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，室溫孵育30min，用破膜打孔液離心洗滌2次。FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)和Flowjo軟件分析。

5.ELISA檢測(cè)血清中細(xì)胞因子水平：按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，在ELISA板中加入相關(guān)細(xì)胞因子的包被抗體，4℃過夜。然后用洗液洗板，加入包被液室溫孵育1 h，封閉非特異性抗原。再次洗板后，加入倍比稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品以及待檢測(cè)血清樣本，室溫孵育2 h，再次洗板后，加入捕獲抗體，室溫作用1 h，洗板，加入顯色底物，室溫作用30min，加入終止液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀讀板。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。CD4+T細(xì)胞各亞群的比例、Th1/Treg、Th2/Treg及Th17/Treg比例和分泌的細(xì)胞因子水平均用±s表示，各組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析以及StudentNewman Keuls檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、外周血CD4+T細(xì)胞亞群的分布

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)進(jìn)展期非節(jié)段型白癜風(fēng)組（NSV）與健康對(duì)照組外周血中CD4+T細(xì)胞亞群比例 Th1，Th2及Th17在單個(gè)核細(xì)胞體外活化后染色，Treg是單個(gè)核細(xì)胞直接染色

如圖1和表1所示，進(jìn)展期NSV組外周血Th1細(xì)胞與Th17細(xì)胞的比例均顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Th2和Treg的比例則與健康對(duì)照組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與健康對(duì)照相比，Th1/Treg與Th17/Treg的比例顯著增高，而Th2/Treg的比例則未發(fā)生顯著變化，見表2。

二、ELISA檢測(cè)血清中細(xì)胞因子水平

在進(jìn)展期NSV組血清中，只有IL-17A的水平顯著高于健康對(duì)照。雖然IFN-γ的含量高于健康對(duì)照，但二者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-4和TGF-β1的水平與健康對(duì)照比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

討 論

本研究闡述了NSV患者進(jìn)展期階段外周循環(huán)中Th1，Th2，Th17和Treg CD4+T細(xì)胞亞群的改變。我們發(fā)現(xiàn)，在NSV處于進(jìn)展期時(shí)，Th1和Th17細(xì)胞反應(yīng)在外周血CD4+T細(xì)胞中占主導(dǎo)地位，而Th2與Treg則未發(fā)生顯著性變化。Th1/Treg與Th17/Treg比例失衡，提示外周循環(huán)中效應(yīng)性T細(xì)胞與抑制性T細(xì)胞免疫平衡已被打亂，說(shuō)明機(jī)體對(duì)黑素細(xì)胞自身抗原已失去耐受。

每個(gè)CD4+T細(xì)胞亞群均可分泌其相應(yīng)的細(xì)胞因子，如Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，Th2細(xì)胞分泌IL-4，Th17細(xì)胞分泌IL-17A及Treg分泌TGF-β1。除Treg外，流式細(xì)胞檢測(cè)也是根據(jù)這些特異的細(xì)胞因子來(lái)界定這些細(xì)胞亞群：CD4+IFN-γ+Th1，CD4+IL-4+Th2，CD4+IL-17A+Th17。體外實(shí)驗(yàn)揭示，上述這4種細(xì)胞因子均可在體外影響黑素細(xì)胞的正常功能甚至可以影響黑素細(xì)胞的存活。據(jù)報(bào)道，IFN-γ和IL-17A體外都能刺激黑素細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，進(jìn)而抑制黑素的產(chǎn)生；IL-4則可直接影響黑素細(xì)胞的黑素生成［2］。IFN-γ［3］和 TGF-β1 體外可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡［4］，TGF-β1還可以抑制黑素細(xì)胞生長(zhǎng)。由此推測(cè)，這些相應(yīng)的細(xì)胞亞群可能在白癜風(fēng)的發(fā)病過程中發(fā)揮作用。

表1 進(jìn)展期非節(jié)段型白癜風(fēng)（NSV）組與健康對(duì)照組外周血中CD4+T細(xì)胞亞群分布比較（%±s）

表1 進(jìn)展期非節(jié)段型白癜風(fēng)（NSV）組與健康對(duì)照組外周血中CD4+T細(xì)胞亞群分布比較（%±s）

注：n=30。a與健康對(duì)照組相比，P＜0.05

?

表2 進(jìn)展期非節(jié)段型白癜風(fēng)（NSV）組與健康對(duì)照組外周血Th1/Treg，Th2/Treg，Th17/Treg比較（±s）

表2 進(jìn)展期非節(jié)段型白癜風(fēng)（NSV）組與健康對(duì)照組外周血Th1/Treg，Th2/Treg，Th17/Treg比較（±s）

注：n=30。與健康對(duì)照組比較，a P＜0.01；b P＜0.05

組別健康對(duì)照組進(jìn)展期NSV組Th1/Treg 1.32±1.17 2.37±1.42a Th2/Treg 0.31±0.16 0.32±0.13 Th17/Treg 0.29±0.12 0.41±0.21b

表3 進(jìn)展期非節(jié)段型白癜風(fēng)（NSV）組與健康對(duì)照組血清中細(xì)胞因子分泌水平比較（±s） ng/L

表3 進(jìn)展期非節(jié)段型白癜風(fēng)（NSV）組與健康對(duì)照組血清中細(xì)胞因子分泌水平比較（±s） ng/L

注：n=30。a與健康對(duì)照組比較，P＜0.001。IFN：干擾素；IL：白細(xì)胞介素；TGF：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子

組別健康對(duì)照組進(jìn)展期NSV組IFN-γ（Th1）29.56±14.76 34.95±14.94 IL-4（Th2）0.2868±0.07 0.2911±0.11 IL-17A（Th17）8.66±1.83 23.08±5.80a TGF-β1（Treg）1321±140.8 1121±181.7

本文結(jié)果顯示，外周血CD4+T細(xì)胞中僅Th1和Th17細(xì)胞發(fā)生了顯著變化。有文獻(xiàn)報(bào)道，在白癜風(fēng)皮損及外周血PBMC中均發(fā)現(xiàn)IFN-γmRNA表達(dá)顯著增高［3］，提示機(jī)體白癜風(fēng)自身免疫傾向于Th1反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展期NSV患者外周血中CD4+IFN-γ+Th1細(xì)胞比例顯著高于健康對(duì)照，這一結(jié)果不僅排除了同樣表達(dá)IFN-γmRNA的CD8+T細(xì)胞的干擾，而且在蛋白水平上證實(shí)了Th1細(xì)胞在外周血中的改變。此外，該發(fā)現(xiàn)還與在白癜風(fēng)皮損及皮損周邊處發(fā)現(xiàn)有分泌IFN-γ的CD4+T細(xì)胞［2］的報(bào)道相呼應(yīng)。盡管我們發(fā)現(xiàn)外周血中Th1細(xì)胞比例增高，但是血清中IFN-γ水平雖略高于健康對(duì)照，差異卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果與Singh等［5］不同，他們發(fā)現(xiàn)IFN-γ水平顯著低于健康對(duì)照。IFN-γ雖然主要由Th1細(xì)胞分泌，但CD8+T細(xì)胞也可以分泌IFN-γ。而我們發(fā)現(xiàn)，外周循環(huán)中CD8+T細(xì)胞并沒有發(fā)生顯著性變化（結(jié)果未顯示），血清中IFN-γ的總體水平可能是受到CD8+T細(xì)胞的影響。因此，僅根據(jù)血清中IFN-γ含量及其mRNA表達(dá)水平，并不能準(zhǔn)確判定外周血中Th1細(xì)胞的變化；而細(xì)胞因子染色檢測(cè)的結(jié)果更能直接體現(xiàn)Th1細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中所占的比例改變。

Th17細(xì)胞是有別于Th1和Th2的另一個(gè)效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群，通過分泌IL-17A在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮作用。隨著其在自身免疫性疾病中的作用被認(rèn)可，人們發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞也參與了白癜風(fēng)的自身免疫，在白癜風(fēng)皮損及血清中都發(fā)現(xiàn)IL-17表達(dá)增高［6-7］。我們的結(jié)果顯示，進(jìn)展期NSV患者Th17在外周血CD4+T細(xì)胞中比例顯著高于健康對(duì)照，同時(shí)血清中其特異性分泌的細(xì)胞因子IL-17A水平也顯著高于健康對(duì)照。這與Wang等［6］發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在白癜風(fēng)皮損周邊的浸潤(rùn)是相符合的。血清中IL-17A表達(dá)增高也與報(bào)道一致［7-8］。我們的數(shù)據(jù)再次證實(shí)，Th17細(xì)胞參與了白癜風(fēng)早期發(fā)病。

有研究發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)患者外周血IL-4mRNA表達(dá)及血清IL-4水平均顯著高于健康對(duì)照［9］。也有研究發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)患者血清IL-4和外周血中Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3mRNA表達(dá)顯著低于正常［10］。有研究報(bào)道，白癜風(fēng)患者血清中IL-4水平很低，無(wú)法檢測(cè)。為了明確白癜風(fēng)外周血中Th2細(xì)胞的變化，我們對(duì)Th2細(xì)胞及其特異性的細(xì)胞因子IL-4與健康對(duì)照進(jìn)行了比較。我們認(rèn)為，在進(jìn)展期NSV患者外周血中，Th2細(xì)胞比例與健康對(duì)照之間沒有差異。而與外周血中的比例變化相對(duì)應(yīng)的是，患者血清中IL-4含量亦沒有發(fā)生顯著變化。

作為機(jī)體內(nèi)免疫抑制細(xì)胞，Treg在白癜風(fēng)自身免疫研究中得到廣泛關(guān)注。一些研究發(fā)現(xiàn)，其在白癜風(fēng)皮損內(nèi)數(shù)量減少［11］，而另一個(gè)研究組發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)皮損內(nèi)其特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)增多，但Treg免疫抑制功能降低［12］。還有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，外周血Treg比例顯著降低并伴有FOXP3mRNA低表達(dá)［13］，或伴有血清TGF-β1低表達(dá)［14］。本研究顯示，在進(jìn)展期NSV患者外周血中，Treg的比例及其標(biāo)志性的細(xì)胞因子TGF-β1與健康對(duì)照均無(wú)顯著差異。我們的結(jié)果與其他實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的外周血中Treg比例報(bào)道存在不一致的情況，可能與各個(gè)實(shí)驗(yàn)室選取的Treg定義標(biāo)準(zhǔn)略有不同有關(guān)。他們是以CD4+CD25+/CD4+Foxp3+作為Treg的界定標(biāo)準(zhǔn)，可是活化后的人CD4+T細(xì)胞CD25/Foxp3的表達(dá)比例及表達(dá)量均會(huì)增加，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)略有不足；而我們是以CD4+CD25+CD127-作為Treg的標(biāo)準(zhǔn)，似更為嚴(yán)格。我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，血清中IL-4和TGF-β1含量沒有顯著性改變，與流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周循環(huán)中Th2和Treg的比例結(jié)果相一致。這些結(jié)果進(jìn)一步支持進(jìn)展期NSV患者外周血中Th1和Th17的主導(dǎo)作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)展期NSV外周血中，存在Th1/Treg及Th17/Treg細(xì)胞比例顯著增高，并伴隨促炎性細(xì)胞因子IL-17A表達(dá)水平顯著增高，提示效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞與抑制性CD4+T細(xì)胞之間平衡被打破，機(jī)體處于免疫活化狀態(tài)。Th1和Th17這兩種效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞，發(fā)生了顯著變化，推測(cè)它們?cè)诎遵帮L(fēng)發(fā)病早期的自身免疫中發(fā)揮了重要的作用。而針對(duì)它們分泌的特異性的細(xì)胞因子進(jìn)行拮抗阻斷，可能是潛在的抑制白癜風(fēng)自身免疫進(jìn)展的手段之一。

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