周生儒 鄒雅茹 劉芝翠 趙肖慶 鄭捷 潘萌

200025上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科

天皰瘡是一種自身免疫性大皰性皮膚病，主要分為尋常型天皰瘡（pemphigus vulgaris，PV）和落葉型天皰瘡（pemphigus foliaceus，PF），而增殖型天皰瘡和紅斑型天皰瘡則分別為它們的亞型。目前公認(rèn)的天皰瘡發(fā)病機(jī)制為患者外周血中存在針對角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞間橋粒結(jié)構(gòu)中的橋粒黏蛋白3（desmoglein 3，Dsg3）和（或）橋粒黏蛋白 1（desmoglein 1，Dsg1）的自身抗體，抗原抗體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附喪失，出現(xiàn)典型的臨床和病理表現(xiàn)［1］。雖然，外周血的抗體循環(huán)分布于全身，但患者的皮損并非均勻分布于全身，這提示，可能存在另外的局部免疫機(jī)制使得頭面部、軀干等脂溢部位成為天皰瘡皮損的好發(fā)部位。研究證實(shí)，真皮內(nèi)免疫細(xì)胞在慢性炎癥性皮膚病中起了重要作用［2-3］。因此，天皰瘡皮損處是否普遍存在淋巴細(xì)胞浸潤，浸潤的淋巴細(xì)胞的類型是什么，浸潤淋巴細(xì)胞與疾病的發(fā)病和維持是否相關(guān)，是我們研究的重點(diǎn)。我們對上海瑞金醫(yī)院皮膚科93例PV和PF患者組織病理切片中真皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的浸潤分布進(jìn)行了研究，并用免疫組化的方法研究浸潤淋巴細(xì)胞的類型，分析浸潤淋巴細(xì)胞與患者外周血抗體滴度的相關(guān)性。

資料與方法

一、資料

1.標(biāo)本來源：天皰瘡活檢標(biāo)本及外周血均來源于2014年1月至2016年12月就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科的PV患者56例，PF患者37例。病理取材為新鮮皮損，PV患者主要為水皰，PF患者主要為糜爛面或結(jié)痂面。所有患者均根據(jù)臨床表現(xiàn)、組織病理、直接免疫熒光等明確診斷。用于免疫組化正常對照的皮膚組織來自皮膚科門診手術(shù)室志愿者。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

2.主要試劑和儀器：兔抗人CD3多克隆抗體、鼠抗人CD20單抗、鼠抗人CD138單抗、購自丹麥Dako公司；DAB免疫組化試劑盒購自福州邁新生物開發(fā)有限公司；抗人Dsg1、Dsg3抗體ELISA試劑盒購自日本MBL公司；iMark酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；光學(xué)顯微鏡購自德國Zeiss公司。

二、方法

1.天皰瘡皮損處淋巴細(xì)胞聚集程度評定：收集93例皮膚活檢標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)切片后HE染色。皮損浸潤淋巴細(xì)胞統(tǒng)計(jì)，參照改良的淋巴細(xì)胞聚集程度的等級評定系統(tǒng)進(jìn)行評定。Grade1定義為徑向細(xì)胞計(jì)數(shù)2～5層，Grade2定義為徑向細(xì)胞計(jì)數(shù)6～10層，Grade3定義為徑向細(xì)胞計(jì)數(shù) ≥ 11層［4］。若細(xì)胞彌散分布，則人為劃定邊界。若淋巴細(xì)胞以橢圓形聚集則取最大最小徑向細(xì)胞計(jì)數(shù)的均值。

2.天皰瘡皮損處淋巴細(xì)胞免疫組化染色：從93例標(biāo)本中選擇8例PV和8例PF樣本進(jìn)行免疫組化染色?？紤]受到免疫組化染色敏感性的限制，為保證有足夠多的淋巴細(xì)胞，在含有Grade2或Grade3淋巴細(xì)胞聚集的樣本中進(jìn)行隨機(jī)選擇。分析患者皮損組織中CD3+T細(xì)胞、CD20+B細(xì)胞、CD138+漿細(xì)胞表達(dá)及其分布情況。免疫組化步驟均按照試劑說明書進(jìn)行，所有染色均設(shè)陽性對照（扁桃體）和陰性對照（正常皮膚）。免疫組化染色結(jié)果判定：CD3、CD20及CD138表達(dá)陽性者均為棕色顆粒，CD3表達(dá)定位于細(xì)胞膜和（或）胞質(zhì)，CD20、CD138表達(dá)定位于細(xì)胞膜。光學(xué)顯微鏡（×200）下觀察每個淋巴細(xì)胞聚集處是否有表達(dá)陽性的細(xì)胞。

3.ELISA法檢測患者血清中特異性自身抗體：用抗Dsg1和Dsg3抗體檢測試劑盒，按產(chǎn)品說明書操作，iMark酶標(biāo)儀在450 nm波長下讀取吸光度。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用Graphpad 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，淋巴細(xì)胞密集程度指數(shù)與抗體滴度的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析方法計(jì)算P值。用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較兩組間差異，數(shù)據(jù)以±sx表示。

結(jié) 果

一、天皰瘡患者皮損局部淋巴細(xì)胞聚集程度判定

對2014年1月至2016年12月就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科的PV患者56例，PF患者37例的HE切片進(jìn)行分析。患者的性別、年齡等臨床資料見表1。天皰瘡局部皮損淋巴細(xì)胞聚集評級的示例見圖1。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，93例病理切片中，93例（100.00%）病理切片有Grade 1淋巴細(xì)胞聚集出現(xiàn)，64例（68.09%）病理切片有Grade 2淋巴細(xì)胞聚集出現(xiàn)，10例（10.06%）病理切片有Grade 3淋巴細(xì)胞聚集出現(xiàn)。PF和PV具有相似的概率，見表2。

93例患者病理切片（×50）鏡頭下Grade1、Grade2、Grade3淋巴細(xì)胞聚集的個數(shù)。每個Grade1淋巴細(xì)胞聚集大約有50個淋巴細(xì)胞，Grade2大約有200個淋巴細(xì)胞，Grade3大約有600個淋巴細(xì)胞［5］。然后以此計(jì)算每例病理切片下淋巴細(xì)胞總數(shù)，定義為淋巴細(xì)胞密集程度指數(shù)。淋巴細(xì)胞的密集程度指數(shù)在PF（925.24± 127.91，n=37）和PV（1 008.77±141.75，n=56）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 93例天皰瘡患者臨床資料

二、PF和PV患者外周血抗Dsg1/Dsg3抗體滴度

用ELISA的方法檢測36例PF患者和55例PV患者外周血抗Dsg1/Dsg3抗體滴度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表3。

三、淋巴細(xì)胞密集程度指數(shù)與抗體滴度的相關(guān)性分析

分析PF患者外周血抗Dsg1抗體滴度、PV患者外周血抗Dsg1抗體滴度、PV患者外周血抗Dsg3抗體滴度與淋巴細(xì)胞密集程度指數(shù)的相關(guān)性。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，淋巴細(xì)胞聚集程度與抗體滴度間無相關(guān)關(guān)系（圖2）。

四、浸潤淋巴細(xì)胞的類型

通過免疫組化分析，在16例中，全部有CD3+T細(xì)胞出現(xiàn)，15例有CD20+B細(xì)胞，12例有CD138+漿細(xì)胞。在PV患者中，7例有CD20+B細(xì)胞出現(xiàn)，6例有CD138+漿細(xì)胞出現(xiàn)。在PF患者中，8例有CD20+B細(xì)胞出現(xiàn)，6例有CD138+漿細(xì)胞出現(xiàn)。圖3示1例天皰瘡患者皮損處CD3+T細(xì)胞、CD20+B細(xì)胞、CD138+漿細(xì)胞聚集。我們觀察鏡下Grade 1～3淋巴細(xì)胞聚集中是否有CD3+T細(xì)胞、CD20+B細(xì)胞、CD138+漿細(xì)胞出現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)在Grade 1～3淋巴細(xì)胞聚集區(qū)域中均含有大量CD3+T細(xì)胞，而含有CD20+B細(xì)胞的聚集占總數(shù)52.80%±5.78%，含有CD138+漿細(xì)胞的聚集占總數(shù)34.59%±7.42%。CD3+T細(xì)胞、CD20+B細(xì)胞、CD138+漿細(xì)胞在PV和PF的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 93例天皰瘡患者淋巴細(xì)胞聚集的病理評級［例（%）］

表3 PF和PV患者外周血抗Dsg1/Dsg3抗體滴度

圖1 天皰瘡皮損處淋巴細(xì)胞聚集程度評級示例 1A：Grade1（HE×400，方框）；1B：Grade 2（HE×400，方框）；1C：代表性Grade3（HE×200，方框）

圖2 淋巴細(xì)胞密集程度指數(shù)與抗體滴度相關(guān)性 2A：PF患者淋巴細(xì)胞密集程度指數(shù)與外周血抗Dsg1抗體滴度無相關(guān)性；2B：PV患者淋巴細(xì)胞密集程度指數(shù)和與外周血抗Dsg1抗體滴度無相關(guān)性；2C：PV患者淋巴細(xì)胞密集程度指數(shù)與外周血抗Dsg3抗體滴度無相關(guān)性

圖3 天皰瘡皮損處浸潤淋巴細(xì)胞示例（HE×200） 3A：天皰瘡皮損處有大量CD3+T細(xì)胞；3B：天皰瘡皮損處有CD20+B細(xì)胞；3C：天皰瘡皮損處有CD138+漿細(xì)胞；3D：正常對照真皮內(nèi)有少量CD3+T細(xì)胞；3E：正常對照真皮內(nèi)無CD20+B細(xì)胞；3F：正常對照真皮內(nèi)無CD138+漿細(xì)胞

討 論

天皰瘡患者血清中存在抗角質(zhì)形成細(xì)胞橋粒結(jié)構(gòu)的Dsg1、Dsg3抗體，該抗體在引發(fā)角質(zhì)形成細(xì)胞間粘附的喪失和水皰形成中起到主要的致病作用。雖然外周血中抗體可以均勻分布于全身皮膚，但是天皰瘡皮損并不累及全部皮膚。皮膚是一個重要的免疫器官，也是天皰瘡自身免疫的靶器官。皮膚局部免疫細(xì)胞的改變與多種皮膚病的發(fā)病息息相關(guān)。例如，白癜風(fēng)皮損局部CD8+T細(xì)胞與其發(fā)病相關(guān)［6］，特應(yīng)性皮炎皮損處CD20+B細(xì)胞大量聚集［7］等。天皰瘡皮損局部是否也可能存在可以誘發(fā)和加重皮損的免疫性機(jī)制尚待研究。

我們對瑞金醫(yī)院皮膚科93例PV和PF患者的病理切片進(jìn)行了回顧性分析，發(fā)現(xiàn)真皮層異位淋巴細(xì)胞的浸潤具有普遍性，而且在PV和PF之間無顯著差別。這說明天皰瘡皮損處普遍存在異位淋巴結(jié)構(gòu)。同時(shí)我們選擇了8例PV患者和8例PF患者進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)在16例樣本中，全部有CD3+T細(xì)胞出現(xiàn)，15例有CD20+B細(xì)胞，12例有CD138+漿細(xì)胞。說明T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞共同存在于天皰瘡皮損處，部分皮損區(qū)域存在漿細(xì)胞，而漿細(xì)胞與IgG共染是陽性的（數(shù)據(jù)未列出）。因此在天皰瘡皮損局部，T細(xì)胞有可能促進(jìn)B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞，漿細(xì)胞產(chǎn)生致病性特異性抗體，需要進(jìn)一步研究。

天皰瘡是一種自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的靶器官普遍存在異位淋巴結(jié)構(gòu)（ectopic lymphoid like，ELS）［8］。ELS是一種在自身免疫靶器官、感染局部、腫瘤局部形成，而抗原清除后可消失的瞬態(tài)結(jié)構(gòu)。ELS的結(jié)構(gòu)具有異質(zhì)性，它可以類似典型的次級淋巴器官（如淋巴結(jié)、扁桃體）即具有生發(fā)中心、分離的B細(xì)胞及T細(xì)胞區(qū)、濾泡狀樹突細(xì)胞及典型的高內(nèi)皮小靜脈等特征性結(jié)構(gòu)；也可僅表現(xiàn)為T、B淋巴細(xì)胞在局部呈團(tuán)塊狀的浸潤［9-10］。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)滑膜、干燥綜合征的唾液腺和淚腺、多發(fā)性硬化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、系統(tǒng)型紅斑狼瘡的腎臟等自身免疫性疾病的靶器官均存在ELS［8］。這些部位的ELS主要以T、B細(xì)胞浸潤的形式存在，只有極少的部位存在典型的生發(fā)中心結(jié)構(gòu)［11-13］。天皰瘡局部的淋巴細(xì)胞浸潤也是以T、B淋巴細(xì)胞成團(tuán)浸潤為主，沒有發(fā)現(xiàn)類似二級淋巴器官的T、B細(xì)胞分區(qū)及生發(fā)中心結(jié)構(gòu)，部分區(qū)域高內(nèi)皮小靜脈染色陽性（數(shù)據(jù)未列出）。這些特征與其他自身免疫性疾病靶器官的ELS特征較為一致，因此我們認(rèn)為天皰瘡局部的淋巴細(xì)胞浸潤也是ELS。

目前研究認(rèn)為,ELS在抗感染免疫和腫瘤免疫中具有保護(hù)作用，而在自身免疫和移植免疫中具有致病作用［8］。研究證實(shí)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)滑膜的ELS中，外周輔助型T細(xì)胞能夠輔助局部B細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性抗體，從而可能對于疾病的發(fā)生發(fā)展有重要作用［14-17］。天皰瘡皮損處ELS中是否存在Dsg抗原特異性T細(xì)胞輔助抗原特異性B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，并進(jìn)一步分泌抗dsg1和（或）dsg3抗體，進(jìn)而產(chǎn)生免疫病理作用，需要進(jìn)一步研究。目前我們的研究沒有發(fā)現(xiàn)天皰瘡局部的異位淋巴細(xì)胞的浸潤程度與外周血抗體滴度具有相關(guān)性。這可能是因?yàn)榍衅课坏恼嫫ち馨图?xì)胞密度不能反映出全身皮膚浸潤淋巴細(xì)胞的程度以及所有皮損的嚴(yán)重程度。進(jìn)一步對天皰瘡皮損處淋巴細(xì)胞致病功能的研究可能需要移植皮損至重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠，觀察特異性抗體產(chǎn)生及淋巴細(xì)胞的存活與增殖。

綜上所述，本文主要闡明了天皰瘡患者皮損普遍存在大量淋巴細(xì)胞浸潤，T、B細(xì)胞共存并呈團(tuán)塊狀浸潤，部分皮損處存在CD138+漿細(xì)胞，可能形成ELS，參與皮損的發(fā)生、發(fā)展和加重。ELS的具體構(gòu)成模式及其功能尚待進(jìn)一步闡明。

志謝上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫所王宏林教授課題組

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