馮月娟王燦燦童岳陽(yáng)郁東偉施凱徐永芳黃旭晴王建峰徐婷呂玉寶徐長(zhǎng)青#

1 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 浙江 杭州 310015

2 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 上海 020040

筆者在前期實(shí)驗(yàn)研究顯示補(bǔ)腎健脾益氣方通過(guò)抑制瘦素及瘦素受體改善實(shí)驗(yàn)性慢性阻塞性肺疾?。–OPD）大鼠免疫炎癥反應(yīng)，為進(jìn)一步揭示該方延緩因COPD導(dǎo)致的骨骼肌丟失的分子生物學(xué)機(jī)制，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑：大鼠血清瘦素、瘦素受體、TNF-α和IL-6試劑盒購(gòu)于上海西塘生物科技有限公司；大鼠骨骼肌瘦素及瘦素受體Real-time PCR試劑盒購(gòu)于寶生物工程有限公司；大鼠骨骼肌瘦素及瘦素受體Westernblot相關(guān)試劑盒購(gòu)于寶生物工程有限公司。

1.2 分組與動(dòng)物模型建立：健康純系SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量120±20g，按體質(zhì)量層次隨機(jī)抽取15只為正常對(duì)照組，基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，連續(xù)12周，余下45只作為慢性阻塞性肺疾?。ê?jiǎn)稱慢阻肺）模型組和補(bǔ)腎健脾益氣方組（高劑量組和低劑量組），利用經(jīng)典熏香煙方案[1]制作大鼠COPD模型。模型組基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，補(bǔ)腎健脾益氣方組中藥灌胃，每天1次（根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥劑量換算表，將人的補(bǔ)腎健脾益氣方臨床劑量換算成大鼠的劑量，分為高劑量和低劑量組，高劑量為原有成人劑量的2倍）。模型組乙醚麻醉，處死取血及后腿骨骼肌，利用小動(dòng)物呼吸機(jī)驗(yàn)證造模成功。

1.3 用藥方案：補(bǔ)腎健脾益氣方，本院制劑室提供，組成：仙靈脾、黃芪各30g，仙茅15g，黨參、白術(shù)、茯苓、懷山藥各10g，補(bǔ)骨脂、山萸肉、柴胡各12g，甘草6g?？勺们樵黾幼咸K、熟地、地龍各12g，麥冬、丹參各15g，川貝5g，五味子9g。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥劑量換算表[2]，將人的補(bǔ)腎健脾益氣方臨床劑量換算成大鼠的劑量，濃縮成2ml藥物,模型組及復(fù)方治療高劑量組和低劑量組每日灌胃1次，連續(xù)灌胃12周。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)：采用ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清瘦素、瘦素受體、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）水平；Real-timePCR檢測(cè)補(bǔ)腎健脾益氣方干預(yù)慢阻肺大鼠骨骼肌瘦素和瘦素受體mRNA水平；Western blot法檢測(cè)慢阻肺大鼠骨骼肌瘦素和瘦素受體蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 18.0版，計(jì)量資料以±s表示，組間統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析，P＜0.05為統(tǒng)計(jì)有差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組血清瘦素、瘦素受體水平比較：見(jiàn)表1。

表1 各組血清瘦素、瘦素受體水平（ng/ml）

2.2 各組血清TNF-α和IL-6水平比較：見(jiàn)表2。

表2 各組血清TNF-α和IL-6水平（ng/ml）

2.3 各組骨骼肌瘦素及其受體mRNA表達(dá)比較：見(jiàn)表3。

表3 各組骨骼肌瘦素和瘦素受體mRNA表達(dá)

2.4 各組大鼠骨骼肌瘦素和瘦素受體蛋白表達(dá)比較：

Western blot檢測(cè)報(bào)告提示，與正常對(duì)照組（光密度值：1426.854）相比較，大鼠慢阻肺模型組（光密度值：149932.163）骨骼肌瘦素和瘦素受體蛋白表達(dá)有所增加（光密度值分別與內(nèi)參GAPDH比較）。與慢阻肺模型組比較，高劑量組和低劑量組瘦素表達(dá)水平有所降低。就骨骼肌瘦素而言，高劑量組光密度值（光密度值：91822.987）較慢阻肺模型組光密度值下降更明顯，提示高劑量組有更強(qiáng)的抑制慢阻肺模型瘦素水平的作用。就骨骼肌瘦素受體而言，與慢阻肺模型組比較，高劑量組（光密度值：73501.658）比低劑量組瘦素受體表達(dá)水平下降明顯。

3 討論

慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期多屬本虛為主，標(biāo)實(shí)為次，肺、脾、腎三臟虛損是COPD發(fā)生發(fā)展及反復(fù)發(fā)作的內(nèi)在條件，“脾為肺之母”，脾虛日久必然損傷氣血津液等精微物質(zhì)化生不足，四肢骨骼肌肉失于濡養(yǎng)，最終導(dǎo)致肌肉萎縮及功能障礙。COPD肌肉萎縮、肌肉乏力和疲勞癥狀屬于中醫(yī)學(xué)“痿癥”“痿蹩。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾在體合肉，主四肢，全身的肌肉四肢，都有賴于脾胃運(yùn)化的水谷精微及津液的營(yíng)養(yǎng)滋潤(rùn)，才能壯實(shí)豐滿，活動(dòng)靈活有力，故強(qiáng)調(diào)健脾的治療。所用方中，仙靈脾、仙茅補(bǔ)肝腎之不足，溫壯元陽(yáng)、溫腎助陽(yáng)納氣；補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎溫脾陽(yáng)；山萸肉滋腎；黨參、白術(shù)、茯苓、懷山藥、炙甘草健脾補(bǔ)中，益氣健脾化痰以堵生痰之源，培土生金，且扶土上可蔭肺，下可制水，實(shí)為治本之法；黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)，益氣固表；北柴胡升舉脾氣，使氣血得予輸布經(jīng)脈五臟。

表1結(jié)果表明，與正常組比較，復(fù)方治療高劑量組和低劑量組血清瘦素水平增加程度較血清瘦素受體水平更加明顯，可能機(jī)制是補(bǔ)腎健脾益氣方具有其他作用機(jī)理可以不經(jīng)過(guò)瘦素受體通路降低血清中瘦素水平，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

慢阻肺特征性病理生理改變是氣道、肺實(shí)質(zhì)及肺血管的慢性炎癥性病變，炎癥細(xì)胞釋放的炎癥因子和炎癥趨化因子在慢阻肺的炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答中起重要作用。表2結(jié)果表明，提示補(bǔ)腎健脾益氣方高劑量組具有明顯的抑制外周血炎癥反應(yīng)的作用，究其原因可能因本復(fù)方中主要藥物淫羊藿具有抑制炎癥反應(yīng)，抑制核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κb）有關(guān)，這個(gè)結(jié)果與淫羊藿單體淫羊藿苷相關(guān)研究結(jié)果相一致[3-4]。

為進(jìn)一步明確補(bǔ)腎健脾益氣方降低血清中瘦素瘦素受體的可能機(jī)制，筆者采用Real-time PCR檢測(cè)各組大鼠后腿骨骼肌中瘦素及瘦素受體mRNA表達(dá)。表3結(jié)果顯示：與正常組比較，大鼠慢阻肺模型組骨骼肌瘦素和瘦素受體mRNA表達(dá)有所升高（P＜0.01），提示慢性炎癥浸潤(rùn)可以增加瘦素及瘦素受體的表達(dá)。與慢阻肺模型組相比較，復(fù)方治療高劑量組和低劑量組骨骼肌瘦素和骨骼肌瘦素受體吸光度均降低，但復(fù)方治療高劑量組降低更加明顯（P＜0.01），提示復(fù)方治療組可以降低骨骼肌瘦素mRNA表達(dá)。

筆者為深入研究，采用Western blot檢測(cè)各組大鼠后腿骨骼肌瘦素及瘦素受體表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與正常組（光密度值：1426.854）比較，大鼠慢阻肺模型組（光密度值：149932.163）骨骼肌瘦素和瘦素受體蛋白表達(dá)有所增加（光密度值分別與內(nèi)參GAPDH比較）。與模型組比較，高劑量組和低劑量組瘦素表達(dá)水平有所降低。就骨骼肌瘦素而言，高劑量組光密度值（光密度值：91822.987）較模型組下降更明顯，提示復(fù)高劑量組有更強(qiáng)的抑制慢阻肺模型瘦素水平的作用。就骨骼肌瘦素受體而言，與模型組比較，高劑量組（光密度值：73501.658）比低劑量組瘦素受體表達(dá)水平下降明顯。

骨骼肌功能障礙作為慢阻肺的主要肺外表現(xiàn)，是評(píng)估慢阻肺預(yù)后的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，慢阻肺患者存在肺腎氣虛、肺脾氣虛[5]，既可造成骨骼肌能量供需障礙，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致其內(nèi)在結(jié)構(gòu)的變化，使得患者的呼吸肌萎軟失用，不耐疲勞，致肺失清宣，而成氣逆喘咳。因此補(bǔ)腎健脾益氣使脾氣得健，有利于加強(qiáng)肌肉的營(yíng)養(yǎng)，減少呼吸肌蛋白的分解，改善骨骼肌能源物質(zhì)的供給，從而增強(qiáng)呼吸肌收縮力及耐力，減輕呼吸肌疲勞，減輕氣促等不適癥狀，提高生活質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)以補(bǔ)腎健脾益氣為法，按照隨機(jī)對(duì)照的原則對(duì)大鼠慢阻肺模型進(jìn)行研究，嘗試評(píng)價(jià)補(bǔ)腎健脾益氣對(duì)于改善慢阻肺的呼吸肌疲勞、抗炎和調(diào)節(jié)免疫等方面的療效，為臨床治療慢性阻塞性肺疾病提供科學(xué)而客觀的實(shí)驗(yàn)研究資料。

[1]林江濤,翁心植.慢性阻塞性肺疾病與肺源性心臟病[M].北京：北京出版社，1999：366-381.

[2]宋小蓮,王昌惠,白沖.脂多糖結(jié)合熏煙法和單純熏煙法建立慢性阻塞性肺病大鼠模型的比較[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,31(3)：246-249.

[3]Xu CQ,Liu BJ,Wu JF,et al.Icariin attenuates LPS-inducedacute in flammatory responses：involvement of PI3K/Akt and NF-kappaB signaling pathway[J].Eur J Pharmacol.2010，642(1-3)：146-153.

[4]吳金峰,董競(jìng)成,徐長(zhǎng)青,等.淫羊藿苷拮抗脂多糖炎癥模型的體內(nèi)和體外研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，29(4)：330-334.

[5]中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)內(nèi)科分會(huì)肺系病專業(yè)委員會(huì).慢性阻塞性肺疾病中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)(2011版)[J].中醫(yī)雜志，2012,53(2)：177-178.