沈建君 張睿 高倩倩 付敏軍 鄭紅斌

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

麥纖散是鄭紅斌教授運(yùn)用麥芽纖維防治潰瘍性結(jié)腸炎（UC）這一訪日留學(xué)研究成果，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)配伍而成。本實(shí)驗(yàn)旨在探討在此基礎(chǔ)上酌加白及組成的新麥纖散對(duì)UC大鼠結(jié)腸黏膜炎癥及血清白介素（IL）-34、IL-35的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物：60只SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200±20g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，常規(guī)飼料進(jìn)食，保證環(huán)境清潔、通風(fēng)。

1.2 藥物：美沙拉嗪緩釋顆粒（上海愛的發(fā)制藥有限公司，批號(hào)：H20143164），于研缽中搗碎，加蒸餾水配成一定濃度的混懸液，4℃保存?zhèn)溆?。精選優(yōu)質(zhì)發(fā)芽大麥，經(jīng)去糖化、烘干、碾碎、堿-酶結(jié)合法提取麥芽纖維。將購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部的優(yōu)質(zhì)茯苓、白及、山藥、馬齒莧、三七制成超細(xì)粉末，過120目標(biāo)準(zhǔn)篩，按照一定比例與麥芽纖維充分混勻制成新麥纖散，加蒸餾水配成一定濃度的混懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑：DSS（美國MP公司，貨號(hào)：0216011080，分子量36000-50000）；IL-34ELISA測試盒[96T，貨號(hào)：CKE95265R，艾萊薩生物科技(上海)有限公司]；IL-35 ELISA測試盒[96T，貨號(hào)：CK-E93202R，艾萊薩生物科技(上海)有限公司]；深藍(lán)大便隱血檢測試劑盒（安徽深藍(lán)醫(yī)療科技股份有限公司，批號(hào)：20152400174）。

2 方法

2.1 分組及造模：60只雄性SD大鼠按每組10只，隨機(jī)分為正常組，模型組，美沙拉嗪組，新麥纖散低、中、高劑量組。用蒸餾水配成5%DSS溶液予大鼠自由飲用，每日更換，連續(xù)7天，正常組則飲用純凈水。當(dāng)造模大鼠出現(xiàn)明顯的腹瀉、黏液膿血便等癥狀時(shí)，說明UC模型成功復(fù)制。

2.2 給藥：UC模型誘導(dǎo)成功后第二天給予相應(yīng)藥物治療。根據(jù)大鼠與人體每公斤體重劑量折算系數(shù)為6.25，美沙拉嗪緩釋顆粒臨床成人急性發(fā)病期適宜攝入量為4g/d，美沙拉嗪組給予美沙拉嗪緩釋顆?；鞈乙?.42g/kg每日灌胃；新麥纖散臨床成人急性發(fā)病期適宜攝入量為5g/d，以其3、6、12倍用量，新麥纖散低、中、高劑量組分別給予新麥纖散混懸液1.5、3、6g/kg每日灌胃；其余組大鼠予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)治療2周。

2.3 標(biāo)本采集：末次給藥24h后，稱量大鼠體重，觀察大鼠糞便性狀，并收集至10ml試管中，按照深藍(lán)大便隱血檢測試劑盒說明書進(jìn)行血便檢測；腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，充分暴露腹主動(dòng)脈，用10ml的注射器采血，1000r/s離心5min后，小心吸取血清分裝到1.5ml無菌EP管中，-20℃保存?zhèn)溆茫蝗庋塾^察結(jié)腸組織，切取病變嚴(yán)重部位，置于10%福爾馬林溶液中固定，用于病理切片制作。

2.4 觀察指標(biāo)與檢測方法：分述如下。

2.4.1 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分：稱量大鼠體重，肉眼觀察大鼠糞便性狀、血便癥狀，利用公式“疾病活動(dòng)指數(shù)=(體重評(píng)分+糞便性狀評(píng)分+隱血評(píng)分)/3”給大鼠做DAI評(píng)分。0分：體重?zé)o下降，大便正常，大便隱血正常；1分：體重下降1%～5%，大便松散，大便隱血陽性；2分：體重下降5%～10%，大便松散，大便隱血陽性；3分：體重下降10%～15%，稀便，肉眼血便；4分：體重下降＞15%，稀便，肉眼血便[1]。

2.4.2 組織病理切片觀察及評(píng)分：取大小約為2.0cm×1.0cm×0.3cm的結(jié)腸標(biāo)本，梯度脫水后，石蠟包埋、切片、HE染色后，觀察并評(píng)估各組結(jié)腸組織的病理變化。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無上皮損傷和潰瘍形成；1分：糜爛，潰瘍深度和浸潤程度在黏膜下層，輕度水腫和炎性細(xì)胞浸潤；2分：潰瘍深度和浸潤程度在肌層，中度水腫和炎性細(xì)胞浸潤；3分：潰瘍深度和浸潤程度在漿膜層，重度水腫和炎性細(xì)胞浸潤。

2.4.3 ELISA法檢測大鼠血清IL-34、IL-35水平：IL-34、IL-35ELISA測試盒置于室溫20min后，在標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl，樣品孔分別加入待測樣本、樣本稀釋液，然后分別加入抗體、顯色劑A和B后，37℃避光孵育15min，再加入終止液50μl，在450nm波長處測定各孔的OD值，參照標(biāo)準(zhǔn)品線性曲線計(jì)算各樣本的表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用±s表示；各組結(jié)果使用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況觀察與DAI評(píng)分比較：正常組大鼠飲食照常，體重增加，糞便成形，無明顯不適癥狀。飲用DSS溶液后，多數(shù)老鼠第二天腹瀉嚴(yán)重、便溏、體重減輕，三四天后有血便癥狀、精神不振、毛發(fā)光澤差，五六天后情況加重，肛周大片穢物黏附、有明顯膿血便。新麥纖散治療后大鼠血便改善，糞便逐漸成形，體重也有所增加。DAI評(píng)分見表1。

3.2 各組結(jié)腸組織病理切片觀察及病理損傷評(píng)分比較：正常組大鼠結(jié)腸黏膜完整，未見潰瘍、水腫，也無炎癥細(xì)胞浸潤，模型組大鼠結(jié)腸黏膜明顯充血水腫、潰瘍形成，杯狀細(xì)胞畸形、減少，腺體排列不規(guī)則，淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤明顯。新麥纖散低中高劑量組結(jié)腸黏膜有不同程度的缺失，少見潰瘍、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，腺體排列較規(guī)則。見圖1、表1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理切片（200×）

3.3 各組血清IL-34、IL-35水平變化比較：見表1。

表1 各組大鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸病理損傷評(píng)分及血清IL-34、IL-35水平比較（±s）

表1 各組大鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸病理損傷評(píng)分及血清IL-34、IL-35水平比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

正常組模型組美沙拉嗪組新麥纖散低劑量組新麥纖散中劑量組新麥纖散高劑量組50.69±5.85 24.33±4.09*40.52±2.88#31.76±2.18#36.27±2.16#34.71±1.51#10 9 10 10 10 10 0.00±0.00 3.51±0.18*0.53±0.32#0.73±0.43#0.57±0.32#0.60±0.31#0.00±0.00 2.33±0.50*0.60±0.21#0.90±0.46#0.65±0.24#0.70±0.26#47.58±7.02 97.04±8.30*59.80±5.56#79.66±4.13#70.63±3.03#71.53±2.29#

4 討論

UC是由多因素導(dǎo)致免疫功能紊亂而介導(dǎo)的慢性炎癥性腸道疾病，病變主要涉及腸道黏膜及黏膜下層，可有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等細(xì)胞浸潤，炎癥貫穿于本病始終。中醫(yī)學(xué)重視濕熱邪氣在UC發(fā)病中的作用，嗜食肥甘厚膩，脾胃斡旋不利，水谷不化，濕邪內(nèi)生，郁久化熱，下注腸道、灼傷腸絡(luò)，日久引起本病的發(fā)生。新麥纖散正是針對(duì)此病因病機(jī)配伍而成，散劑中麥芽消食助運(yùn)；茯苓、山藥化濕和中，健脾固腸；馬齒莧清腸解毒止?。蝗?、白及止血排膿，化瘀斂瘡。諸藥共奏清腸解毒化濕、健脾厚腸斂瘡之功。

研究表明，IL-34參與并加重UC的炎癥反應(yīng)[2]，IL-35則與UC的疾病活動(dòng)度呈負(fù)相關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在DSS誘導(dǎo)的UC大鼠模型中，血清IL-34呈現(xiàn)高表達(dá)，而IL-35的表達(dá)水平則顯著降低。應(yīng)用新麥纖散治療后，血清IL-34水平降低，而IL-35水平升高，同時(shí)UC大鼠的DAI評(píng)分降低，結(jié)腸組織損傷減小，潰瘍和炎癥程度減輕，這表明新麥纖散可能通過抑制IL-34的分泌，上調(diào)IL-35的表達(dá)，起到抗炎愈潰作用，從而有效改善腸道黏膜炎癥，對(duì)UC大鼠有較好的療效。

[1]Sánchez-Fidalgo S，Cárdeno A，Sánchez-HidalgoM，et al.Dietary extra virgin olive oil polyphenols supplementation modulates DSS-induced chronic colitis in mice[J].Journal of Nutritional Biochemistry，2013，24(7)：1401-1413.

[2]汪洋，邵建國，卞兆連，等．白細(xì)胞介素-34及其在炎癥性腸病中的作用[J].國際消化病雜志，2016，36（5）：264-268.

[3]唐文靜，王婷婷，汪良芝．IL-35在炎癥性腸病中的表達(dá)及臨床價(jià)值[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2016，11（2）：142-144.