樓招歡李波俞靜靜呂圭源

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 浙江省中藥治療高血壓及相關(guān)疾病藥理研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江 杭州 310053

桑抹茶是新鮮桑葉經(jīng)特殊抹茶工藝制成的天然超細(xì)粉末，前期研究顯示其具有良好的降血脂作用，并具有促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)潛能[1]。本文擬進(jìn)一步觀察桑抹茶對(duì)高脂血癥模型大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)及膽固醇流出相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用及可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物：SD大鼠，雄性，體重200±20g，40只，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001，動(dòng)物合格證號(hào)：NO.0016674。于室溫23±2℃，相對(duì)濕度50%～70%飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑：阿托伐他?。ˋtorvastatin Calcium Capsules，河南天方藥業(yè)股份有限公司131010109，10mg/粒），臨用前用蒸餾水配制成濃度為0.6mg/mL的混懸液。桑抹茶由新鮮桑葉冷凍干燥后經(jīng)球磨機(jī)碾碎成超細(xì)粉末，臨用前取上述樣品適量，用純水配置成90、60、30mg/ml的混懸液，即得。膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒均購(gòu)自寧波美康生物科技有限公司；一氧化氮試劑盒（NO，20151228，南京建成科技有限公司）；DAPI、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）(A0562，碧云天)；免疫組化二抗試劑盒（ab64264，abcam公司）；肝X受體α（LXRα；YT5143，Immuno Way）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α/γ（PPARα/γ；15540-1-AP，Proteintech和YM3443，Immuno Way）、高脂飼料購(gòu)自特洛菲飼料科技有限公司。

1.3 儀器：ACCUTE TBA-40FR全自動(dòng)生化分析儀（東芝三廠醫(yī)療株式會(huì)社）；Power wave 340酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-TEK儀器有限公司）；SAKURA Tissue-Tek VIP 5Jr自動(dòng)脫水機(jī)，日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會(huì)社；MEIKO EC360包埋機(jī)，德國(guó)MEIKO公司；LEICARM2245切片機(jī)，德國(guó)LEICA公司；生物顯微鏡BA410，Motic公司；Adavance 3.2圖像分析系統(tǒng)，Motic公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與給藥：將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，稱定體質(zhì)量，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和造模組，除正常對(duì)照組大鼠外，其余大鼠給予高脂飼料，2周后禁食12h后眼眶靜脈叢采血，測(cè)定血清中TC水平，根據(jù)TC水平隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（阿托伐他汀6.0mg/kg）、桑抹茶組(900、600、300mg/kg)，每組8只。所有大鼠均給予高脂飼料，連續(xù)4周，自由采食飲水。同時(shí)除正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服蒸餾水外，其余各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，每日1次，灌胃容積為1ml/100g體質(zhì)量，連續(xù)4周。

2.2 血脂水平檢測(cè)：于給藥后第4周眼眶取血（取血前禁食不禁水12h），37℃水浴1h，3500r/min，離心10min，取上清液即血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清血脂生化指標(biāo)（TC、TG、LDL-C、HDL-C），并計(jì)算動(dòng)脈硬化指數(shù)（AI=(CTC-CHDL-C)/CHDL-C）。

2.3 血清一氧化氮水平檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)期末，眼眶采血，37℃水浴1h，3500r/min，離心10min，取上清，按照說(shuō)明書(shū)采用硝酸還原酶法測(cè)定血清中NO水平。

2.4 HE染色觀察胸主動(dòng)脈組織病理學(xué)：各組大鼠解剖后取胸主動(dòng)脈相同部位，4%中性福爾馬林緩沖溶液固定72h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片、HE染色，中性樹(shù)脂封片，光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

2.5 主動(dòng)脈PPARγ/α、LXRα表達(dá)的檢測(cè)：采用免疫組化法和免疫熒光法。主動(dòng)脈石蠟切片免疫組化DAB顯色法：梯度二甲苯脫蠟→梯度乙醇水化→抗原修復(fù)→滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶→5%BSA封閉→孵育抗PPARγ/α、LXRα一抗或PBS→孵育二抗→DAB顯色→蘇木素染核→脫水→二甲苯透明→封片→鏡下觀察，黃色為陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果；同時(shí)設(shè)置PBS代替抗PPARγ/α、LXRα一抗的同步陰性對(duì)照。石蠟切片PPARγ免疫熒光染色：梯度二甲苯脫蠟→梯度乙醇水化→抗原修復(fù)→5%BSA封閉→孵育PBS或抗PPARγ一抗→孵育FIFC標(biāo)記的熒光二抗→DAP1染核→防熒光淬滅封片劑封片→熒光倒置顯微鏡下觀察；綠色熒光為PPARγ陽(yáng)性表達(dá)，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核的表達(dá)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)血脂水平的影響：圖1結(jié)果顯示，與正常組比較，給予高脂飼料2w后，各模型組大鼠血清TC、LDL-C水平顯著升高（P＜0.01），HDL-C水平顯著降低（P＜0.01），動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)AI顯著增大（P＜0.01）；各造模組大鼠TG水平有增高趨勢(shì)，但各組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。給予桑抹茶（FM）干預(yù)4w后，與模型組比較，F(xiàn)M各劑量組大鼠血清TC、LDL-C水平及AI均顯著下降（P＜0.01，P＜0.05），0.9、0.6g/kg能顯著增加模型大鼠血清HDL-C水平（P＜0.05，P＜0.01）；各組間TG水平無(wú)顯著性差異。

3.2 對(duì)模型大鼠胸主動(dòng)脈病變及血清NO水平的影響：HE染色表明，正常組大鼠胸主動(dòng)脈壁由三層組成，內(nèi)膜層有豐富的內(nèi)皮細(xì)胞；中膜較厚，由多層彈性膜組成，彈性膜間有平滑肌、少量膠原纖維和彈性纖維；外膜較薄，由結(jié)締組織構(gòu)成；與正常組比較，模型組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞有脫落，彈性膜層排列紊亂，中膜增厚，并有輕微的早期脂紋。與模型組比較，F(xiàn)M各劑量組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜脫落減輕，彈性膜層排列較整齊，中膜增厚有改善（圖3A）。ELISA結(jié)果顯示，與正常組比較，模型大鼠血清NO水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，F(xiàn)M0.9g/kg和0.6g/kg能顯著升高血清NO水平（P＜0.01）（圖3B）。

圖1 造模2周各組大鼠血脂水平

圖2 給藥4周各組大鼠血脂水平

圖3 A：胸主動(dòng)脈HE染色代表性顯微圖片（200×）；B：各組血清NO水平

3.3 對(duì)主動(dòng)脈PPARγ/α、LXRα蛋白表達(dá)的影響：免疫組化結(jié)果表明，PPARγ/α、LXRα在主動(dòng)脈細(xì)胞核表達(dá)（見(jiàn)圖4、5）；PPARγ免疫組化DAB顯色法和免疫熒光的結(jié)果類似（見(jiàn)圖5）。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠主動(dòng)脈PPARγ、LXRα表達(dá)明顯降低，PPARα有升高趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異；與模型對(duì)照組比較，F(xiàn)M各劑量組大鼠主動(dòng)脈PPARγ、LXRα表達(dá)有增加趨勢(shì)，PPARα有降低趨勢(shì)，其中對(duì)LXRα和PPARα的作用以0.3g/kg劑量較為顯著，對(duì)PPARγ的作用以0.9、0.6g/kg劑量較為明顯。

圖4 主動(dòng)脈PPARα、LXRα表達(dá)代表性顯微圖片（DAB染色，200×）

圖5 主動(dòng)脈PPARγ表達(dá)代表顯微圖片（A：DAB染色，200×；B：熒光染色，200×）

4 討論

AS是心腦血管病的病理基礎(chǔ)，已知血脂代謝異常是其重要誘因。由異常升高的LDL氧化修飾形成的氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），侵入并沉積于血管內(nèi)膜，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，由單核細(xì)胞黏附并活化的巨噬細(xì)胞通過(guò)清道夫受體吞噬ox-LDL形成泡沫細(xì)胞，促進(jìn)了AS的發(fā)生發(fā)展。本文研究結(jié)果顯示，與正常組比，模型大鼠給予高脂飼料6w后，血清中TC、LDL-C水平及AI顯著升高，血管內(nèi)皮細(xì)胞有脫落，單核細(xì)胞黏附于內(nèi)膜，中膜增厚；給予FM干預(yù)，能有效降低TC、LDL-C及AI，改善內(nèi)膜損傷，提示FM有一定的預(yù)防AS作用。

血管內(nèi)皮功能紊亂是AS心血管病理生理改變的始動(dòng)因素。內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）產(chǎn)生的NO，具有舒張血管、抗炎、抗血栓等作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO的減少，可導(dǎo)致血管舒縮功能紊亂，促進(jìn)AS及高血壓等的發(fā)生發(fā)展。研究表明，高脂血癥可抑制eNOS的表達(dá)，減少NO的合成與釋放[2]，降低血中NO濃度，減弱其抗AS的作用[3]。本文研究結(jié)果表明，模型大鼠血清NO水平顯著降低，而不同劑量FM干預(yù)，能顯著升高血清NO的含量，減輕主動(dòng)脈病理改變程度。

肝X受體（LXRs）是一種氧化型固醇激活的核受體，其在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)、糖代謝及炎癥過(guò)程中起了重要作用，LXRα為其亞型之一。以往研究顯示，LXRs通過(guò)調(diào)控靶基因ApoE、ABCA1、ABCG1等，促進(jìn)膽固醇從細(xì)胞內(nèi)流向細(xì)胞膜并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，阻止膽固醇在血管壁等過(guò)多的堆積，防止AS的發(fā)生發(fā)展。此外，LXRs與PPAR通路偶聯(lián)，PPARγ通過(guò)降低清道夫受體（SR-A）的表達(dá)、增強(qiáng)CLA/SR-BI、ABCA1、LXR的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，對(duì)泡沫細(xì)胞形成負(fù)性調(diào)節(jié)作用；此外，PPARγ表達(dá)上調(diào)在AS發(fā)生的最早期，可以通過(guò)抑制血管壁上單核/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來(lái)阻斷AS的發(fā)生發(fā)展。本文研究結(jié)果顯示，模型大鼠胸主動(dòng)脈LXRα、PPARγ表達(dá)量明顯低于正常組大鼠，給予FM干預(yù)，能有效增加模型大鼠血管LXRα、PPARγ表達(dá)量。提示，F(xiàn)M可能可以通過(guò)活化LXRα、PPARγ，促進(jìn)血管壁巨噬細(xì)胞膽固醇流出，從而防止血管壁脂質(zhì)沉積。

綜上所述，桑抹茶通過(guò)降低高脂血癥模型大鼠血清TC、LDL-C水平，增加血清NO水平及血管LXRα/PPARγ表達(dá)，促進(jìn)膽固醇流出，改善血管內(nèi)皮功能，具有潛在的抗AS作用。

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