王曉陽 黃麗芳 閆林 周華 陳金煥 孫燕 董云萍

摘要 為分析我國咖啡種質(zhì)遺傳背景，提高咖啡資源保護與利用效率，利用31個SSR分子標記對我國主要的92份咖啡種質(zhì)進行遺傳多樣性檢測。結(jié)果表明.92份咖啡種質(zhì)遺傳相似系數(shù)變幅為0.666～0. 997，平均為0. 85，其中小粒種咖啡種內(nèi)平均遺傳相似系數(shù)為0.923。在遺傳多樣性分析基礎上，利用5個SSR標記構(gòu)建了25個中粒種咖啡品系的DNA指紋圖譜。研究表明，我國咖啡種質(zhì)資源遺傳基礎非常狹窄，利用現(xiàn)有咖啡資源開展品種選育潛力有限，應加強對野生特異種質(zhì)的引種與發(fā)掘利用。

關鍵詞 咖啡;SSR;遺傳多樣性;指紋圖譜

咖啡與可可、茶同列世界三大飲料作物，在世界熱帶農(nóng)業(yè)經(jīng)濟、國際貿(mào)易及人們生活中占有重要地位。我國咖啡種植主要分布在云南、海南和四川等省，全國種植面積約3 000萬hm²，總產(chǎn)量約12萬t，是我國主要熱帶經(jīng)濟作物。

咖啡（Coffea Linn.）原產(chǎn)非洲埃塞俄比亞及剛果河流域，為茜草科咖啡屬植物，該屬包含大約100個種[1]，其中，具有商業(yè)栽培價值的主要為小粒種（C.arabica L.）和中粒種（C. canephora Pierre ex A.Froelzner），其余種類主要作為種質(zhì)資源和育種材料保存。我國咖啡資源主要來自于國外引種。目前，國內(nèi)收集保存咖啡種質(zhì)約700份，保存機構(gòu)主要為云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所、中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所、云南省農(nóng)業(yè)科學院熱帶亞熱帶經(jīng)濟作物研究所等科研單位（以下分別簡稱德宏所、香飲所、熱經(jīng)所），另有少量由咖啡企業(yè)自行引進保存，相當一部分種質(zhì)存在重復保存。

我國咖啡種質(zhì)資源引種渠道多元，保存較為分散，種質(zhì)保存機構(gòu)間相互引種且獨立命名，難免存在種質(zhì)重復引進、品種同種異名、異名同種，以及種質(zhì)間親緣關系不清等問題，給咖啡育種親本選擇及優(yōu)良品種推廣應用帶來不便。對我國現(xiàn)有咖啡資源開展遺傳多樣性分析并進行指紋圖譜構(gòu)建，對于我國咖啡核心種質(zhì)庫構(gòu)建、資源高效利用及品種推廣具有重要意義。

國內(nèi)相關學者利用形態(tài)學標記開展了咖啡種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[2]，這種方法雖然簡便、經(jīng)濟，但形態(tài)學標記數(shù)量有限，且易受環(huán)境條件的影響.黃麗芳[3]、閆林[4]等利用RAPD、ISSR等分子標記進行了咖啡種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建。RAPD、ISSR標記為隨機性顯性標記，結(jié)果可重復性有待提高。SSR分子標記為特異性共顯性標記，穩(wěn)定性好、結(jié)果可靠，非常適合遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建，現(xiàn)已廣泛應用于水稻[5]、甘薯[6]、土豆[7]、大豆[8]、玉米[9]等許多作物的遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建。本研究利用SSR分子標記對我國主要咖啡種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，并對我國現(xiàn)有中粒種咖啡品種進行了DNA指紋譜圖構(gòu)建，為生產(chǎn)上品種真實性和純度鑒定、優(yōu)良品種推廣應用提供技術支持，也為我國咖啡遺傳改良、育種親本選配、種質(zhì)保護、核心種質(zhì)庫構(gòu)建等提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料取自國內(nèi)三大咖啡種質(zhì)保存單位：德宏所、香飲所及熱經(jīng)所，共計92份，其中，小粒種59份、中粒種25份、大粒種8份（表1）。樣本包括我國咖啡主栽品種、國外引進品種、自主選育品種及其它種質(zhì)，基本涵蓋了我國現(xiàn)有咖啡主要種質(zhì)。采集咖啡種質(zhì)葉片樣本，利用硅膠干燥劑干燥保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

利用植物DNA提取試劑盒（品牌：TIAhGEN，產(chǎn)品型號：DP320）進行咖啡葉片樣本DNA提取。

1.2.2 SSR標記檢測

SSR引物來自相關文獻發(fā)表的咖啡特異性SSR引物。PCR總反應體系為20μL，組分包括：2 ng/μL基因組DNA， 1.5 mmol/L MgCl₂，0.2mmol dNTP，0.2μmol/L引物，0.03 U/μL Taq酶，1×PCR緩沖液。SSR-PCR擴增反應程序采用Touch-down PCR：94℃4min， 15個Touch-down循環(huán)（940C 15 s，600C 15 s，72℃ 30s，每次循環(huán)的退火溫度降0.7℃），15個普通循環(huán)（94℃ 15s，49.5℃ 15 s，72℃ 30 s），最后于72℃延伸20 min。擴增產(chǎn)物于6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離檢測，銀染法顯帶分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

統(tǒng)計SSR擴增條帶，在相同位點上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，利用Excel軟件建立數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS-pc2.10y分析軟件通過加權平均法（UPMGA）計算遺傳相似系數(shù)并進行聚類分析。篩選條帶清晰、多態(tài)性強的SSR引物用于指紋圖譜構(gòu)建。對SSR標記擴增條帶進行圖形化處理;同一位點上有帶用黑色方格表示.無帶用白色方格表示，據(jù)此構(gòu)建咖啡品系DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性SSR引物篩選

通過相關文獻檢索.共獲取410對咖啡特異性SSR引物[10-16]。利用小粒種（CIFC7963 （F6）、TYPICA）、中粒種（越南-1、泰國4-2）、中小粒雜交種（ARABUSTA）及大粒種（南頂）共6份種質(zhì)對獲得的410對SSR引物進行多態(tài)性篩選，共篩選出多態(tài)性SSR引物152對，從中繼續(xù)篩選出條帶清晰的多態(tài)性SSR引物31對（表2），用于后續(xù)遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建。

2.2 遺傳多樣性分析

利用篩選出的31對SSR引物對92份咖啡種質(zhì)進行了擴增檢測（部分引物檢測結(jié)果見圖1）。通過遺傳相似性分析，結(jié)果表明.92份咖啡種質(zhì)遺傳相似系數(shù)變幅為0. 666～0. 997 [‘CIFC7963 （F6）與‘德熱199-1相似系數(shù)為1，二者可能存在同種異名情況]，平均遺傳相似系數(shù)為0. 85，大粒種、中粒種種內(nèi)平均遺傳相似系數(shù)分別為0. 849、0.85，小粒種種內(nèi)平均遺傳相似系數(shù)高達0. 923，表明我國小粒種咖啡種質(zhì)資源遺傳基礎非常狹窄。進一步分析小粒種、中粒種、大粒種咖啡種間遺傳相似系數(shù)，結(jié)果表明，種間平均遺傳相似系數(shù)為0.764，在遺傳相似系數(shù)分析基礎上進行聚類分析，結(jié)果表明，在相似系數(shù)約0.8處可以大致將小粒種、中粒種、大粒種3個種分開（圖2）。

2.3 指紋圖譜構(gòu)建

從31對SSR引物中篩選擴增條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性好的引物，對25個中粒種咖啡品系進行指紋圖譜構(gòu)建。結(jié)果表明，利用5對SSR引物（CMA41、CMA159、CM5、368、471，引物序列見表2）即可將25個中粒種咖啡品系完全區(qū)分開。5對SSR引物在25個中粒種品系中共擴增出20條清晰譜帶，每對引物平均4條，CMA41引物擴增情況見圖1。通過對SSR擴增條帶進行圖形化處理，獲得了25個中粒種咖啡品系的SSR標記指紋圖譜（圖3）。

3 討論

3.1 我國咖啡遺傳多樣性

本研究在國內(nèi)首次利用SSR分子標記分析了我國咖啡種質(zhì)資源的遺傳多樣性。92份咖啡種質(zhì)平均遺傳相似系數(shù)為0.85，其中小粒種種內(nèi)平均相似系數(shù)高達0.923，表明我國咖啡種質(zhì)資源尤其是小粒種種質(zhì)資源遺傳基礎十分狹窄。咖啡在我國為外來引進作物，在國內(nèi)無野生自然分布。我國現(xiàn)有咖啡種質(zhì)很大一部分是為滿足生產(chǎn)實際需求而引進的育成品種。目前世界現(xiàn)有咖啡育成品種主要來自于Typica、Bourbon、Timor hybrid及其變種等少數(shù)親本材料，育成品種間遺傳多樣性十分狹窄，利用現(xiàn)有咖啡品種資源開展優(yōu)良品種選育潛力十分有限?，F(xiàn)有咖啡育成品種的遺傳基礎僅占世界所有咖啡種質(zhì)資源遺傳基礎的很小一部分，加強對野生咖啡種質(zhì)資源優(yōu)異性狀的發(fā)掘與利用對于現(xiàn)有咖啡品種遺傳改良具有重要意義[17]。利用現(xiàn)有育成品種與野生特異性種質(zhì)雜交，進而培育優(yōu)良雜交品種已逐漸成為咖啡品種選育的趨勢，目前，已培育出一系列具有高產(chǎn)、抗病、優(yōu)質(zhì)等優(yōu)良性狀的咖啡雜交新品種[18]。

3.2 咖啡分子標記指紋圖譜構(gòu)建

中粒種和小粒種作為世界兩大咖啡商業(yè)栽培種，對其品種與種質(zhì)資源開展指紋圖譜構(gòu)建具有重要意義。由于同屬但不同種，二者形態(tài)學差異較大，成年植株一般肉眼即可對所屬物種進行辨認區(qū)分.種子或幼苗也可利用種間特異性SSR標記進行快速鑒別[20]，因此，只需分別對二者進行指紋圖譜構(gòu)建即可。

中粒種咖啡為異花授粉植物，相較自花授粉的小粒種咖啡，品種間遺傳距離相對較大，更易于構(gòu)建指紋圖譜。本研究利用5對SSR引物構(gòu)建了國內(nèi)25個主要中粒種咖啡品系的DNA指紋圖譜。5對SSR引物共擴增出20條帶，條帶數(shù)量較少，便于品種鑒定比對、可操作性強，且所有擴增條帶清晰、穩(wěn)定、可重復性好，對實際生產(chǎn)中優(yōu)良品種鑒定與推廣應用具有實際生產(chǎn)意義。利用12對SSR引物可將59份小粒種種質(zhì)中的大部分區(qū)分開.但仍有相當一部分未能區(qū)分，這可能與種質(zhì)間親緣關系過近，甚至種質(zhì)重復引進、同種異名有關，如其中的CIFC7963（F6）、P1、P2、P3、P4、P5、PT、T5715、T8667同為Catimor系列品種，親緣關系十分接近，引種過程中也容易出現(xiàn)混淆。通過遺傳多樣性對現(xiàn)有小粒種咖啡種質(zhì)進行親緣關系分析，進而構(gòu)建核心種質(zhì)資源庫，在此基礎上進行小粒種核心種質(zhì)指紋圖譜構(gòu)建更具可操作性，也更具實際應用意義。

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