伍嬋翠, 劉 杰, 張學(xué)洪

(1. 桂林電子科技大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 廣西 桂林 541004; 2. 廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院, 廣西 南寧 530004; 3. 桂林理工大學(xué), 廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 桂林 541004)

大多數(shù)植物根系都能夠分泌出低相對(duì)分子質(zhì)量的有機(jī)酸,如檸檬酸、蘋果酸和草酸[1]。這些有機(jī)酸既能在土壤固相中,又能在根際土壤溶液中與金屬離子發(fā)生反應(yīng),增加金屬在根際環(huán)境中的流動(dòng)性,從而提高重金屬的植物有效性[2]。在超富集植物中,根系分泌的有機(jī)酸還可增加土壤中金屬離子的溶解度,并與根系分泌物中的某些物質(zhì)形成穩(wěn)定的金屬螯合物復(fù)合體,從而減輕重金屬對(duì)植物的毒害作用[3]。有機(jī)酸也被認(rèn)為參與了有毒金屬元素的耐受和富集[4]。因此,根系中有機(jī)酸的分析對(duì)于深入認(rèn)識(shí)超富集植物的生理生態(tài)學(xué)適應(yīng)機(jī)制顯得尤其重要。

采用不同方法檢測(cè)植物根系中有機(jī)酸的研究已有報(bào)道。趙寬等[5]建立了植物根莖葉及根系分泌物中有機(jī)酸的離子色譜分析測(cè)定方法,并從4種不同植物的根系分泌物中檢測(cè)出草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和丁二酸。鄢盛堯等[6]采用酶動(dòng)力學(xué)分光光度法測(cè)定油茶根系分泌物中的檸檬酸和蘋果酸。張力等[7]利用飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定了樟樹幼苗根系分泌物中的低相對(duì)分子質(zhì)量有機(jī)酸。這些儀器分析方法在使用中都存在一定的問(wèn)題:離子色譜法易受介質(zhì)干擾,對(duì)樣品的要求較高;酶動(dòng)力學(xué)分光光度法測(cè)量誤差較大,影響因素較多;飛行時(shí)間質(zhì)譜法因離子在離開離子源時(shí)初始能量不同,使得具有相同質(zhì)荷比的離子達(dá)到檢測(cè)器時(shí)有一定的時(shí)間分布,易造成分辨能力下降。此外,根系分泌物有200多種,其種類和數(shù)量隨植物類型、根際環(huán)境而異[8]。植物間親緣關(guān)系越遠(yuǎn),根系分泌物組分和數(shù)量差異越大,根系分泌物的種類和數(shù)量還隨外界環(huán)境脅迫的不同而改變[9]。李氏禾(LeersiahexandraSwartz)是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道的鉻超富集植物[10],它對(duì)土壤中的鉻有很強(qiáng)的吸收和富集能力[11]。目前,對(duì)鉻超富集植物根系分泌物中有機(jī)酸成分的分析尚未見報(bào)道。其根系分泌物中的有機(jī)酸,可以在一定程度上改變土壤中鉻的溶解度[12],能與土壤固、液相中的金屬離子發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng),對(duì)李氏禾吸收和耐受土壤中的鉻污染物起到了至關(guān)重要的作用。

本文以李氏禾的根系分泌物為研究對(duì)象,采用高效液相色譜(HPLC),通過(guò)對(duì)檢測(cè)條件的優(yōu)化,旨在建立一個(gè)準(zhǔn)確、快捷的方法同時(shí)檢測(cè)李氏禾根系分泌物中的低相對(duì)分子質(zhì)量有機(jī)酸組分。此外,本研究采用溶液收集法獲取李氏禾的根系分泌物,與土培收集法[13]和原位收集法[14]相比,操作簡(jiǎn)單,易于進(jìn)一步分析。與現(xiàn)有文獻(xiàn)[13,15]相比,收集到的根系分泌物無(wú)需通過(guò)離子交換樹脂和萃取等前處理,濃縮后即可適用于定量分析。本研究的檢測(cè)結(jié)果將會(huì)對(duì)進(jìn)一步研究李氏禾對(duì)鉻的耐受機(jī)制、解毒機(jī)制和富集機(jī)制提供重要的信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜系統(tǒng)(515泵,717 plus自動(dòng)進(jìn)樣器, 2996紫外吸收檢測(cè)器,Empower色譜工作站,美國(guó)Waters公司); UPW-20N超純水器(北京歷元電子儀器); LRH-550-GSI人工氣候箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司); RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); PHS-3C酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);水相針式過(guò)濾器(直徑13 mm,孔徑為0.45 μm,天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

草酸(oxalic acid)、甲酸(formic acid)、乙酸(acetic acid)、乳酸(lactic acid)、酒石酸(tartaric acid)、檸檬酸(citric acid)、蘋果酸(malic acid)、馬來(lái)酸(maleic acid),均為標(biāo)準(zhǔn)品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)Merck公司);其他化學(xué)試劑均為分析純(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

XSelect HSS T3色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,美國(guó)Waters公司);流動(dòng)相為40 mmol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液(pH=2.40);流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm;柱溫25 ℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 植物材料

李氏禾適合生長(zhǎng)在溪旁、稻田和沼澤地里[10]。本次實(shí)驗(yàn)用的李氏禾采至桂林市靈川縣靈田鄉(xiāng)花江邊上。其生長(zhǎng)茂盛且分布廣泛,是本實(shí)驗(yàn)理想的實(shí)驗(yàn)材料。

1.3.2 植物培養(yǎng)

選取生長(zhǎng)一致的李氏禾幼苗,用去離子水洗凈,放入含有1.5 L 25% (體積分?jǐn)?shù)) Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液的塑料盆中,于人工氣候箱中培養(yǎng)10 d。每天加入去離子水保持培養(yǎng)液的體積,每3天更換一次營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)條件為:光周期12 h,溫度25 ℃,相對(duì)濕度75%,光照強(qiáng)度7 000 Lx。

1.3.3 根分泌物的收集

第十天光照2 h后將李氏禾取出,先用蒸餾水沖洗根部3次,在新制備的超純水中加入幾滴0.05%(體積分?jǐn)?shù))的百里酚水溶液[16],浸泡李氏禾根部5 min,再用超純水清洗根部3次。將李氏禾放入300 mL 0.5 mmol/L的CaCl2溶液中[17],每杯加入3滴0.05%(體積分?jǐn)?shù))的百里酚溶液,放回培養(yǎng)箱中光照收集4 h。4 h后,收集液用0.45 μm的濾膜抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(40 ℃, 90 r/min)濃縮后,再用氮?dú)獯蹈?最后定容至2 mL,放于冰箱中冷藏備用。

1.3.4 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取草酸、檸檬酸、馬來(lái)酸、蘋果酸、酒石酸各0.500 0 g,分別用超純水溶解并定容至10 mL;用移液槍移取甲酸、乙酸、乳酸各5.0 mL,分別用超純水定容至25、50、50 mL。放置于冰箱中保存,檢測(cè)時(shí)用現(xiàn)配的流動(dòng)相稀釋成所需濃度。

圖 1 不同流動(dòng)相條件下8種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of mixed standard solutions of eight organic acids with different mobile phases a. mobile phase: acetonitrile-water (10∶90, v/v) (pH=3.00); b. mobile phase: 40 mmol/L KH2PO4 buffered aqueous solution (pH=2.40).

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜流動(dòng)相的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的組成

現(xiàn)有的采用高效液相色譜法檢測(cè)有機(jī)酸的報(bào)道中有的采用有機(jī)試劑做流動(dòng)相[18],有的采用無(wú)機(jī)溶液及緩沖溶液做流動(dòng)相[19-21]。本研究分別選擇了乙腈-水溶液和KH2PO4-H3PO4磷酸緩沖溶液作為流動(dòng)相,以比較兩者對(duì)混合有機(jī)酸的分離效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,采用乙腈-水(10∶90,體積比)溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.00)作為流動(dòng)相并不能對(duì)8種有機(jī)酸進(jìn)行有效分離(見圖1a)。故本實(shí)驗(yàn)考慮采用KH2PO4-H3PO4緩沖溶液作為流動(dòng)相。

2.1.2 流動(dòng)相的濃度

分別配制了10、20、30、40、50 mmol/L KH2PO4溶液(用H3PO4調(diào)節(jié)pH至2.40),以考察不同濃度對(duì)分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)KH2PO4溶液的濃度小于40 mmol/L時(shí),酒石酸和甲酸、乳酸和乙酸不能有效分離;當(dāng)KH2PO4溶液的濃度為40 mmol/L和50 mmol/L時(shí),分離效果無(wú)明顯區(qū)別,8種有機(jī)酸能較好地實(shí)現(xiàn)分離。從節(jié)約成本的角度考慮,選擇40 mmol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液作為流動(dòng)相。

2.1.3 流動(dòng)相的pH值

用H3PO4分別將流動(dòng)相的pH值調(diào)節(jié)至2.20、2.40和2.60,以考察pH值對(duì)分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,pH值為2.20時(shí)出峰較慢,峰形較寬;pH值為2.40時(shí)各有機(jī)酸分離效果最佳(見圖1b); pH值為2.60時(shí)酒石酸和甲酸分離效果不理想。因此,選擇40 mmol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液(pH=2.40)作為流動(dòng)相。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)

檢測(cè)波長(zhǎng)是影響峰響應(yīng)值的一個(gè)重要因素?；谟袡C(jī)酸在200～240 nm范圍內(nèi)有較強(qiáng)的紫外吸收,本研究考察了205、220和230 nm 3個(gè)波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖2)表明,8種有機(jī)酸在205 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收峰,故本實(shí)驗(yàn)選用205 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖 2 不同波長(zhǎng)下有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of a mixed standard solution at different wavelengths

2.3 流速

其他條件不變,分別以1.2、1.0、0.8和0.6 mL/min的流動(dòng)相流速對(duì)有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,流速高于1.0 mL/min時(shí)柱壓明顯升高,當(dāng)流速為1.2 mL/min時(shí)柱壓約14.5 MPa;流速低于1.0 mL/min,分離時(shí)間不斷延長(zhǎng)。綜合考慮分析時(shí)間和色譜柱柱壓兩個(gè)因素,最終選擇最佳流速為1.0 mL/min, 8種有機(jī)酸能在13 min內(nèi)完成很好的分離。

經(jīng)優(yōu)化后,在13 min內(nèi)即可分離出8種有機(jī)酸,且峰形良好。因此,本實(shí)驗(yàn)的最佳色譜條件確定如下:以40 mmol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液(pH=2.40)為流動(dòng)相,流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃,在波長(zhǎng)205 nm處紫外檢測(cè)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

根據(jù)前述實(shí)驗(yàn)步驟和條件,將系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液依次等體積進(jìn)樣,以峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x, mg/L)進(jìn)行線性回歸,8種有機(jī)酸的線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)(R2)、線性范圍見表1。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋,取S/N=3時(shí)組分的質(zhì)量濃度為檢出限(見表1)。

2.4.2 回收率和精密度

為檢驗(yàn)該方法的準(zhǔn)確性,分別進(jìn)行了回收率試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)。在優(yōu)化的條件下對(duì)李氏禾根系分泌物樣本進(jìn)行檢測(cè)，樣本中各有機(jī)酸背景值見表2。

表 1 各有機(jī)酸的線性關(guān)系和檢出限Table 1 Linear relationships and limits of detection (LODs) of the organic acids

*y: peak area;x: mass concentration, mg/L. ** LODs were determined based on signal to noise ratio of 3 (S/N=3).

表 2 根分泌物中有機(jī)酸的回收率和精密度(n=5)Table 2 Recoveries and precisions of the organic acids spiked in the root exudate sample (n=5)

n.d.: not detected.

向樣本中分別添加高、中、低濃度的各有機(jī)酸,在優(yōu)化的色譜條件下測(cè)定并計(jì)算各有機(jī)酸的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),平行測(cè)定5次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表2)表明,除草酸外,其余各有機(jī)酸的回收率為94.54%～109.98%。精密度均在可接受的范圍內(nèi)。充分證明了該方法的準(zhǔn)確性。該方法的線性范圍及分析結(jié)果的精密度和回收率都能滿足植物根系分泌物中有機(jī)酸定性和定量分析的要求。

2.5 樣品的測(cè)定

采用優(yōu)化后所確定的方法對(duì)李氏禾根系分泌物中的有機(jī)酸成分進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)保留時(shí)間對(duì)樣品的色譜峰定性。用于根分泌物收集的0.5 mmol/L CaCl2溶液也通過(guò)同樣的方法預(yù)處理后進(jìn)行檢測(cè)。將植物根系分泌物樣品的色譜圖同CaCl2溶液的色譜圖作對(duì)比(見圖3),確定3.035 min的色譜峰為溶劑峰。由于溶劑峰的保留時(shí)間與草酸非常接近,雖然對(duì)草酸的定性分析沒(méi)有影響,但卻在一定程度上影響了草酸定量分析的準(zhǔn)確性。這也是草酸的加標(biāo)回收率在74%左右的原因。在后續(xù)的研究中可嘗試降低CaCl2的濃度,或用超純水代替CaCl2溶液作為收集液,或在收集過(guò)程中增加曝氣[22],以消除溶劑峰對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。

圖 3 (a)根系分泌物樣品和(b)用于根分泌物收集的0.5 mmol/L CaCl2溶液的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of (a) the sample of rootexudates and (b) 0.5 mmol/L CaCl2 solution used for root exudates collection

結(jié)果表明,李氏禾根系分泌物中可檢測(cè)出草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、馬來(lái)酸和檸檬酸6種有機(jī)酸?？紤]到溶劑峰對(duì)草酸定量分析準(zhǔn)確性的影響,只對(duì)其進(jìn)行定性,不計(jì)算其含量。其余5種有機(jī)酸含量分別為酒石酸(130.90±1.44) μg/g(根干重)、蘋果酸(1 031.34±4.38) μg/g(根干重)、乳酸(65.54±1.01) μg/g(根干重)、馬來(lái)酸(0.960 00±0.003 67) μg/g(根干重)和檸檬酸(201.50±1.13) μg/g(根干重)。其中蘋果酸含量最高,馬來(lái)酸含量最低。另外,甲酸和乙酸未檢出。由此可見,蘋果酸是李氏禾根系分泌物有機(jī)酸中的優(yōu)勢(shì)組分。另外,檸檬酸和酒石酸也大量存在于李氏禾的根系分泌物中。

3 結(jié)論

本方法的建立為鉻超富集植物根系分泌物中有機(jī)酸的研究提供了重要的檢測(cè)手段。本方法可應(yīng)用于后期研究中,以考察不同營(yíng)養(yǎng)條件及脅迫條件下李氏禾根分泌物中有機(jī)酸成分的變化。檢測(cè)結(jié)果對(duì)進(jìn)一步探尋根系分泌物中有機(jī)酸對(duì)鉻的作用機(jī)理,以及李氏禾對(duì)鉻的耐受機(jī)制、解毒機(jī)制和富集機(jī)制都將具有重要意義。

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