達(dá)熱拜·熱達(dá)提，趙為民，曾祥岳，楊新輝

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830011）

胃癌是全世界范圍內(nèi)都較為常見的惡性腫瘤[1]，在任何年齡段都可能發(fā)生，且多見于40～60歲，男性多于女性。這可能與社會(huì)的發(fā)展使得人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的改變及不良生活習(xí)慣等有關(guān)，確切的誘發(fā)病因至今不明。目前胃癌治療的主要方案為外科手術(shù)，但由于大多數(shù)早期胃癌患者其身體并無癥狀，只有少數(shù)會(huì)有嘔吐、惡性或是類似于上消化道潰瘍病癥狀的表現(xiàn)[2]。一旦發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)體重減輕或身體疼痛時(shí)，多數(shù)患者已經(jīng)發(fā)展到進(jìn)展期，對(duì)人們的生活和健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3]，因此，發(fā)現(xiàn)對(duì)早期胃癌防治及預(yù)后能產(chǎn)生有效特異性標(biāo)志物顯得尤為重要。本研究缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）和甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（glycine methyltransferase，GNMT）在胃癌組織中和癌旁正常組織的表達(dá)及與患者預(yù)后關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年6月-2016年6月本院收治的45例的胃癌患者為觀察對(duì)象。分別采集患者胃癌組織與癌旁正常組織標(biāo)本。其中，男性28例，女性17例；年齡28～78歲，平均（58.34±9.28）歲；腫瘤位置：噴門6例，胃底8例，胃體4例，胃竇27例；腫瘤大?。海? cm 23例，≥6 cm 22例；分化程度：高分化12例，中分化25例，低分化8例；T分期：T1+T225例，T3+T420例；淋巴轉(zhuǎn)移：有21例，無24例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ 29例，Ⅲ+Ⅳ 16例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①患者均確診為胃癌；②術(shù)前未進(jìn)行放化療等；③所有病患或其家屬均知情并簽字同意參與研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前有放化療治療；②拒絕參與研究的患者。所有患者均簽署知情同意書，本文獲得我院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR） 提取標(biāo)本組織RNA，采用購自Invitrogen公司的Trizol試劑，嚴(yán)格按照說明書操作。將組織樣本置入EP管中（內(nèi)含無RNA酶2 ml），并將1 ml Trizol加入管中，在液氮中研磨后于常溫中靜置5 min后將0.2 ml氯仿滴入管中并搖晃15 s，然后繼續(xù)靜置10 min（常溫）。以12 000 r/min進(jìn)行15 min離心（溫度為4℃），將上清液分離出加入新的EP管（內(nèi)含無RNA酶1.5 ml），并將0.5 ml異丙醇加入管中并混合均勻后常溫下靜置3 min，再以12 000 r/min進(jìn)行15 min離心（溫度為4℃）后將上清液倒掉，加入1 ml乙醇（濃度為75%）對(duì)RNA沉淀進(jìn)行洗滌。再以12 000 r/min進(jìn)行8 min離心（溫度為4℃）后將上清液倒掉，乙醇完全揮發(fā)后將高溫滅菌后的50 μl MiliQ純水（焦碳酸二乙酯對(duì)其進(jìn)行處理）。采用逆轉(zhuǎn)試劑將mRNA逆轉(zhuǎn)為cDNA（購自Toyobo公司），采用7900HT序列儀將cDNA進(jìn)行qRT-PCR（購自美國生物公司），每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，算出其相對(duì)值。

1.2.2 提取蛋白并行Western blot檢測(cè) 使用RIPA裂解法提取蛋白，裂解時(shí)為降低蛋白降解速度加入PMSF等蛋白酶的抑制劑。將裂解物以12 000 r/min進(jìn)行10 min離心（溫度為4℃）后分離上清液并對(duì)其蛋白總濃度進(jìn)行測(cè)定，BCA試劑盒購于碧云天生物。將3×蛋白緩沖液適量加入裂解液中，行10 mim沸水浴后蛋白變性，行膠上電泳后將蛋白置于PVDF膜上。用TBST制成脫脂牛奶（濃度為5%）中封閉保存PVDF膜1 h，將封閉液洗干凈后孵育HIF-1α抗體（購自Abcam公司，濃度為1∶1 500）。在4℃冰箱冷凍保存12 h以上，進(jìn)行清洗并繼續(xù)孵育1 h（用兔二抗），進(jìn)行清洗后用濃度為1∶3 000的GAPDH進(jìn)行顯影（購自Vazyme公司）。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）對(duì)癌組織以及旁邊組織GNMT表達(dá)。用GNMT的引物序列經(jīng)PCR儀器增加，并計(jì)算其相對(duì)值。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 用購于聯(lián)世科技的ELISA試劑盒對(duì)GNMT進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑說明書在各個(gè)孔中分別加入樣品，并恒溫（37℃）孵育2 h后將試劑A加入其中后繼續(xù)孵育1 h，將反應(yīng)液吸出后洗滌3次后將試劑B加入其中，恒溫（37℃）孵育30 min，將反應(yīng)液吸出后洗滌5次后將90 μl反應(yīng)物底物加入繼續(xù)恒溫（37℃）孵育20 min，將50 μl終止液加入并進(jìn)行吸光度檢測(cè)。

1.3 效果評(píng)價(jià)

染色以及免疫組織化學(xué)（免疫組化）結(jié)果判斷：將樣本制成芯片后對(duì)其進(jìn)行相關(guān)處理（脫蠟和水化），用濃度為3%的H2O2對(duì)其過氧化物酶進(jìn)行滅活（常溫下密閉10 min），并與高溫高壓下恢復(fù)抗原熱，將抗原抗體反應(yīng)（非特異性）經(jīng)牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）進(jìn)行封閉；將購自Abcam公司，濃度為1∶300的HIF-1α以及其公司生產(chǎn)的濃度為1∶400的CD34加入后在4℃下進(jìn)行過夜孵育；給予磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）進(jìn)行洗滌，孵育兔二抗，常溫下保持30 min用PBS進(jìn)行洗滌；進(jìn)行5～10 min避光顯色后終止顯色（用自來水洗滌）。陽性百分率的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)如下[4]：0分為細(xì)胞無著色；1分為細(xì)胞著色≤ 25%；2分為細(xì)胞著色范圍在26%～74%；3分為細(xì)胞著色＞75%。染色強(qiáng)度的評(píng)判：無著色0分；淡黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。陰性表達(dá)：陽性百分率×染色強(qiáng)度≤2分，陽性表達(dá)：陽性百分率×染色強(qiáng)度＞2分。將陽性百分比和染色強(qiáng)度的評(píng)分結(jié)果相乘，即為綜合評(píng)分，用判定陽性表達(dá)強(qiáng)度，綜合評(píng)分0～1分判定為表達(dá)陰性（-），2～5分判定為表達(dá)弱陽性（+），6～8分判定為表達(dá)中度陽性（++），9分判定為表達(dá)強(qiáng)陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較做χ2檢驗(yàn)。影響胃癌患者5年生存結(jié)局的多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和癌旁正常組織中HIF-1α的表達(dá)

HIF-1α在胃癌組織中的陽性率為84.44%，高于癌旁正常組織的陽性率4.45%；HIF-1α在胃癌組織胞核的陽性率為64.44%，高于胞質(zhì)的陽性率20.00%。見表1和圖1、2。

2.2 GNMT在胃癌組織及癌旁組織的表達(dá)

GNMT在胃癌組織（678.23±221.88）ng/ml的表達(dá)低于癌旁正常組織（1136.73±332.81）ng/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.689，P=0.000）。GNMT在胃癌組織的表達(dá)低于癌旁正常組織（P＜0.05）。

表1 胃癌組織和癌旁正常組織中HIF-1α胞核陽性率及胞質(zhì)陽性率的比較 （n =45）

圖1 胃癌組織胞核中HIF-1α表達(dá)陽性 （免疫組化）

圖2 胃癌組織胞質(zhì)中HIF-1α表達(dá)陽性 （免疫組化）

2.3 患者5年生存結(jié)局的獨(dú)立因素分析

多因素Cox回歸分析顯示，影響胃癌患者5年生存結(jié)局的獨(dú)立因素包括HIF-1α蛋白（+）表達(dá)（P=0.002）、GNMT蛋白（-）表達(dá)（P =0.006）、分化程度（P=0.036）、浸潤(rùn)深度（P =0.001)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P =0.002）。見表 2。

3 討論

胃癌發(fā)病率在消化系統(tǒng)腫瘤中占據(jù)40%～50%比例，發(fā)病率與致殘率在惡性腫瘤中占比最高[5-7]。胃癌的治療目前為放化療、手術(shù)及中醫(yī)措施和對(duì)患者免疫力進(jìn)行提升等綜合療法，由于胃癌患者一旦發(fā)現(xiàn)絕大部分是已屬發(fā)展期[8-10]，且具有較為復(fù)雜的分化、組織成分及生物型行為，療效滿意度低，為此如何有效防治胃癌成為醫(yī)療工作者研究的重點(diǎn)和焦點(diǎn)。找尋特異而又敏感的腫瘤分子類標(biāo)志，在基因以及分子水平對(duì)胃癌進(jìn)行生物學(xué)檢測(cè)，更深層次的對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了解，能提高早期診斷率，從而及早制定方案并改善患者預(yù)后[11]。

本文HIF-1α在胃癌組織胞核的表達(dá)陽性率高于胞質(zhì)的陽性率，且均高于癌旁正常組織中胞核和胞質(zhì)的陽性率。表明HIF-1α的表達(dá)主要集中存在于胃癌組織的胞核與胞質(zhì)，說明HIF-1α進(jìn)入胞核才能對(duì)調(diào)控血管內(nèi)皮中的生長(zhǎng)因子產(chǎn)生作用，進(jìn)而調(diào)控基質(zhì)金屬酶的表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)產(chǎn)生影響[12-13]。HIF-1α在胃癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，而GNMT胃癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織。表明HIF-1α與GNMT對(duì)胃癌組織與癌旁正常組織表達(dá)之間差異較大，臨床可通過檢測(cè)患者HIF-1α與GNMT表達(dá)來對(duì)胃癌進(jìn)行評(píng)估。GNMT作為多功能的一種蛋白質(zhì)在人體內(nèi)能參與到致癌環(huán)境物質(zhì)代謝過程中起到解毒作用，GNMT作為多環(huán)芳烴與蛋白相結(jié)合物質(zhì)在解毒途中對(duì)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行截獲，能有效抑制腫瘤[14]。有報(bào)道稱，GNMT減少表明腫瘤感性物會(huì)有所增加，提示GNMT在腫瘤發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮著作用[15]。本研究還發(fā)現(xiàn)，在胃癌預(yù)后單或多因素分析中，性別、年齡及位置無差異，與分化程度、T分期及淋巴轉(zhuǎn)移等比較均有差異，表明胞核HIF-1α表達(dá)是危險(xiǎn)因子，且對(duì)預(yù)后不會(huì)產(chǎn)生獨(dú)立作用。有報(bào)道表明，胃癌組織中GNMT表達(dá)與TNM腫塊呈負(fù)相關(guān)，與分化程度呈正相關(guān)，由此得出GNMT與胃癌的發(fā)病進(jìn)展具有相關(guān)性。

綜上所述，HIF-1α與GNMT在胃癌組織中高表達(dá)，并且與胃癌預(yù)后有關(guān)系，可作為預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一，不過還有待大量的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

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