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        缺氧誘導(dǎo)因子1α與甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

        2018-03-05 09:05:07達(dá)熱拜熱達(dá)提趙為民曾祥岳楊新輝
        關(guān)鍵詞:胃癌

        達(dá)熱拜·熱達(dá)提,趙為民,曾祥岳,楊新輝

        (新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 胃腸外科,新疆 烏魯木齊 830011)

        胃癌是全世界范圍內(nèi)都較為常見的惡性腫瘤[1],在任何年齡段都可能發(fā)生,且多見于40~60歲,男性多于女性。這可能與社會(huì)的發(fā)展使得人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的改變及不良生活習(xí)慣等有關(guān),確切的誘發(fā)病因至今不明。目前胃癌治療的主要方案為外科手術(shù),但由于大多數(shù)早期胃癌患者其身體并無癥狀,只有少數(shù)會(huì)有嘔吐、惡性或是類似于上消化道潰瘍病癥狀的表現(xiàn)[2]。一旦發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)體重減輕或身體疼痛時(shí),多數(shù)患者已經(jīng)發(fā)展到進(jìn)展期,對(duì)人們的生活和健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3],因此,發(fā)現(xiàn)對(duì)早期胃癌防治及預(yù)后能產(chǎn)生有效特異性標(biāo)志物顯得尤為重要。本研究缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)和甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(glycine methyltransferase,GNMT)在胃癌組織中和癌旁正常組織的表達(dá)及與患者預(yù)后關(guān)系。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料

        選取2015年6月-2016年6月本院收治的45例的胃癌患者為觀察對(duì)象。分別采集患者胃癌組織與癌旁正常組織標(biāo)本。其中,男性28例,女性17例;年齡28~78歲,平均(58.34±9.28)歲;腫瘤位置:噴門6例,胃底8例,胃體4例,胃竇27例;腫瘤大?。海? cm 23例,≥6 cm 22例;分化程度:高分化12例,中分化25例,低分化8例;T分期:T1+T225例,T3+T420例;淋巴轉(zhuǎn)移:有21例,無24例;TNM分期:Ⅰ+Ⅱ 29例,Ⅲ+Ⅳ 16例。入選標(biāo)準(zhǔn):①患者均確診為胃癌;②術(shù)前未進(jìn)行放化療等;③所有病患或其家屬均知情并簽字同意參與研究。排除標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前有放化療治療;②拒絕參與研究的患者。所有患者均簽署知情同意書,本文獲得我院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

        1.2 方法

        1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR) 提取標(biāo)本組織RNA,采用購自Invitrogen公司的Trizol試劑,嚴(yán)格按照說明書操作。將組織樣本置入EP管中(內(nèi)含無RNA酶2 ml),并將1 ml Trizol加入管中,在液氮中研磨后于常溫中靜置5 min后將0.2 ml氯仿滴入管中并搖晃15 s,然后繼續(xù)靜置10 min(常溫)。以12 000 r/min進(jìn)行15 min離心(溫度為4℃),將上清液分離出加入新的EP管(內(nèi)含無RNA酶1.5 ml),并將0.5 ml異丙醇加入管中并混合均勻后常溫下靜置3 min,再以12 000 r/min進(jìn)行15 min離心(溫度為4℃)后將上清液倒掉,加入1 ml乙醇(濃度為75%)對(duì)RNA沉淀進(jìn)行洗滌。再以12 000 r/min進(jìn)行8 min離心(溫度為4℃)后將上清液倒掉,乙醇完全揮發(fā)后將高溫滅菌后的50 μl MiliQ純水(焦碳酸二乙酯對(duì)其進(jìn)行處理)。采用逆轉(zhuǎn)試劑將mRNA逆轉(zhuǎn)為cDNA(購自Toyobo公司),采用7900HT序列儀將cDNA進(jìn)行qRT-PCR(購自美國生物公司),每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),算出其相對(duì)值。

        1.2.2 提取蛋白并行Western blot檢測(cè) 使用RIPA裂解法提取蛋白,裂解時(shí)為降低蛋白降解速度加入PMSF等蛋白酶的抑制劑。將裂解物以12 000 r/min進(jìn)行10 min離心(溫度為4℃)后分離上清液并對(duì)其蛋白總濃度進(jìn)行測(cè)定,BCA試劑盒購于碧云天生物。將3×蛋白緩沖液適量加入裂解液中,行10 mim沸水浴后蛋白變性,行膠上電泳后將蛋白置于PVDF膜上。用TBST制成脫脂牛奶(濃度為5%)中封閉保存PVDF膜1 h,將封閉液洗干凈后孵育HIF-1α抗體(購自Abcam公司,濃度為1∶1 500)。在4℃冰箱冷凍保存12 h以上,進(jìn)行清洗并繼續(xù)孵育1 h(用兔二抗),進(jìn)行清洗后用濃度為1∶3 000的GAPDH進(jìn)行顯影(購自Vazyme公司)。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)對(duì)癌組織以及旁邊組織GNMT表達(dá)。用GNMT的引物序列經(jīng)PCR儀器增加,并計(jì)算其相對(duì)值。

        1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 用購于聯(lián)世科技的ELISA試劑盒對(duì)GNMT進(jìn)行檢測(cè),嚴(yán)格按照試劑說明書在各個(gè)孔中分別加入樣品,并恒溫(37℃)孵育2 h后將試劑A加入其中后繼續(xù)孵育1 h,將反應(yīng)液吸出后洗滌3次后將試劑B加入其中,恒溫(37℃)孵育30 min,將反應(yīng)液吸出后洗滌5次后將90 μl反應(yīng)物底物加入繼續(xù)恒溫(37℃)孵育20 min,將50 μl終止液加入并進(jìn)行吸光度檢測(cè)。

        1.3 效果評(píng)價(jià)

        染色以及免疫組織化學(xué)(免疫組化)結(jié)果判斷:將樣本制成芯片后對(duì)其進(jìn)行相關(guān)處理(脫蠟和水化),用濃度為3%的H2O2對(duì)其過氧化物酶進(jìn)行滅活(常溫下密閉10 min),并與高溫高壓下恢復(fù)抗原熱,將抗原抗體反應(yīng)(非特異性)經(jīng)牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)進(jìn)行封閉;將購自Abcam公司,濃度為1∶300的HIF-1α以及其公司生產(chǎn)的濃度為1∶400的CD34加入后在4℃下進(jìn)行過夜孵育;給予磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)進(jìn)行洗滌,孵育兔二抗,常溫下保持30 min用PBS進(jìn)行洗滌;進(jìn)行5~10 min避光顯色后終止顯色(用自來水洗滌)。陽性百分率的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)如下[4]:0分為細(xì)胞無著色;1分為細(xì)胞著色≤ 25%;2分為細(xì)胞著色范圍在26%~74%;3分為細(xì)胞著色>75%。染色強(qiáng)度的評(píng)判:無著色0分;淡黃色1分;棕黃色2分;棕褐色3分。陰性表達(dá):陽性百分率×染色強(qiáng)度≤2分,陽性表達(dá):陽性百分率×染色強(qiáng)度>2分。將陽性百分比和染色強(qiáng)度的評(píng)分結(jié)果相乘,即為綜合評(píng)分,用判定陽性表達(dá)強(qiáng)度,綜合評(píng)分0~1分判定為表達(dá)陰性(-),2~5分判定為表達(dá)弱陽性(+),6~8分判定為表達(dá)中度陽性(++),9分判定為表達(dá)強(qiáng)陽性(+++)。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,比較做χ2檢驗(yàn)。影響胃癌患者5年生存結(jié)局的多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 胃癌組織和癌旁正常組織中HIF-1α的表達(dá)

        HIF-1α在胃癌組織中的陽性率為84.44%,高于癌旁正常組織的陽性率4.45%;HIF-1α在胃癌組織胞核的陽性率為64.44%,高于胞質(zhì)的陽性率20.00%。見表1和圖1、2。

        2.2 GNMT在胃癌組織及癌旁組織的表達(dá)

        GNMT在胃癌組織(678.23±221.88)ng/ml的表達(dá)低于癌旁正常組織(1136.73±332.81)ng/ml,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.689,P=0.000)。GNMT在胃癌組織的表達(dá)低于癌旁正常組織(P<0.05)。

        表1 胃癌組織和癌旁正常組織中HIF-1α胞核陽性率及胞質(zhì)陽性率的比較 (n =45)

        圖1 胃癌組織胞核中HIF-1α表達(dá)陽性 (免疫組化)

        圖2 胃癌組織胞質(zhì)中HIF-1α表達(dá)陽性 (免疫組化)

        2.3 患者5年生存結(jié)局的獨(dú)立因素分析

        多因素Cox回歸分析顯示,影響胃癌患者5年生存結(jié)局的獨(dú)立因素包括HIF-1α蛋白(+)表達(dá)(P=0.002)、GNMT蛋白(-)表達(dá)(P =0.006)、分化程度(P=0.036)、浸潤(rùn)深度(P =0.001)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P =0.002)。見表 2。

        3 討論

        胃癌發(fā)病率在消化系統(tǒng)腫瘤中占據(jù)40%~50%比例,發(fā)病率與致殘率在惡性腫瘤中占比最高[5-7]。胃癌的治療目前為放化療、手術(shù)及中醫(yī)措施和對(duì)患者免疫力進(jìn)行提升等綜合療法,由于胃癌患者一旦發(fā)現(xiàn)絕大部分是已屬發(fā)展期[8-10],且具有較為復(fù)雜的分化、組織成分及生物型行為,療效滿意度低,為此如何有效防治胃癌成為醫(yī)療工作者研究的重點(diǎn)和焦點(diǎn)。找尋特異而又敏感的腫瘤分子類標(biāo)志,在基因以及分子水平對(duì)胃癌進(jìn)行生物學(xué)檢測(cè),更深層次的對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了解,能提高早期診斷率,從而及早制定方案并改善患者預(yù)后[11]。

        本文HIF-1α在胃癌組織胞核的表達(dá)陽性率高于胞質(zhì)的陽性率,且均高于癌旁正常組織中胞核和胞質(zhì)的陽性率。表明HIF-1α的表達(dá)主要集中存在于胃癌組織的胞核與胞質(zhì),說明HIF-1α進(jìn)入胞核才能對(duì)調(diào)控血管內(nèi)皮中的生長(zhǎng)因子產(chǎn)生作用,進(jìn)而調(diào)控基質(zhì)金屬酶的表達(dá),對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)產(chǎn)生影響[12-13]。HIF-1α在胃癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織,而GNMT胃癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織。表明HIF-1α與GNMT對(duì)胃癌組織與癌旁正常組織表達(dá)之間差異較大,臨床可通過檢測(cè)患者HIF-1α與GNMT表達(dá)來對(duì)胃癌進(jìn)行評(píng)估。GNMT作為多功能的一種蛋白質(zhì)在人體內(nèi)能參與到致癌環(huán)境物質(zhì)代謝過程中起到解毒作用,GNMT作為多環(huán)芳烴與蛋白相結(jié)合物質(zhì)在解毒途中對(duì)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行截獲,能有效抑制腫瘤[14]。有報(bào)道稱,GNMT減少表明腫瘤感性物會(huì)有所增加,提示GNMT在腫瘤發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮著作用[15]。本研究還發(fā)現(xiàn),在胃癌預(yù)后單或多因素分析中,性別、年齡及位置無差異,與分化程度、T分期及淋巴轉(zhuǎn)移等比較均有差異,表明胞核HIF-1α表達(dá)是危險(xiǎn)因子,且對(duì)預(yù)后不會(huì)產(chǎn)生獨(dú)立作用。有報(bào)道表明,胃癌組織中GNMT表達(dá)與TNM腫塊呈負(fù)相關(guān),與分化程度呈正相關(guān),由此得出GNMT與胃癌的發(fā)病進(jìn)展具有相關(guān)性。

        綜上所述,HIF-1α與GNMT在胃癌組織中高表達(dá),并且與胃癌預(yù)后有關(guān)系,可作為預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一,不過還有待大量的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

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