張璐，龔旭昊，范強(qiáng)

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

在進(jìn)行獸藥檢驗(yàn)時(shí)，檢驗(yàn)環(huán)境的變化、儀器的限制、方法的不完善及操作的不規(guī)范等，使檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生誤差。正確表達(dá)含有誤差的檢驗(yàn)結(jié)果及評(píng)價(jià)檢驗(yàn)結(jié)果的可信程度，可使檢驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確，檢驗(yàn)結(jié)論更科學(xué)可靠。

測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，用來定量表示測(cè)量結(jié)果的可信程度[1]。測(cè)量不確定度對(duì)測(cè)量結(jié)果臨界值的判斷、檢測(cè)方法的確認(rèn)和測(cè)量結(jié)果與國際接軌具有重要意義。試驗(yàn)根據(jù)CNAS-GL06:2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》及相關(guān)規(guī)定[2]，參考相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)高效液相色譜法測(cè)定金芩芍注射液含量的不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)[3]，探討其在中藥注射劑定量檢驗(yàn)中的應(yīng)用，提高檢驗(yàn)結(jié)論的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Waters e2695，2489UV/Vis Detector)；電子天平(METTLER TOLEDO，XS205)；250 mL單標(biāo)線容量瓶(A級(jí))；25 mL單標(biāo)線容量瓶(A級(jí))；5 mL單標(biāo)線移液管(A級(jí))；乙腈(色譜級(jí)，默克公司)；0.4%磷酸水溶液：量取4 mL磷酸(批號(hào)：20161215，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)置試劑瓶中，加水至1000 mL，搖勻。綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：Z0261702，98.3%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；金芩芍注射液(批號(hào)：20160701，規(guī)格：10 mL)。

1.2 色譜條件 色譜柱：XBridgeTMC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸水(13∶87)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm。

1.3 對(duì)照品溶液的制備 取綠原酸對(duì)照品12.50 mg，精密稱定，置250 mL容量瓶中，加流動(dòng)相適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.4 供試品溶液的制備 取3支供試品混勻[4]，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.5 數(shù)學(xué)模型 本試驗(yàn)數(shù)學(xué)模型為：

式中：CX為供試品中綠原酸的濃度；AX為供試品溶液的峰面積；AS為對(duì)照品溶液的峰面積；W為對(duì)照品的稱樣量(mg)；p為對(duì)照品的純度；VS為對(duì)照品溶液的體積(mL)；V1為供試品的量取體積(mL)；V2為供試品的定容體積(mL)。

1.6 測(cè)定步驟分析及結(jié)果計(jì)算模型 在上述條件下，分別測(cè)定供試品溶液與對(duì)照品溶液，并按公式計(jì)算綠原酸含量。具體步驟如圖1。

圖1 金芩芍注射液含量測(cè)定試驗(yàn)步驟Fig 1 Steps of mensuration of the content of Jinqinshao Injection

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量不確定度主要來源及分析 測(cè)量過程中不確定度的來源主要有以下三個(gè)方面(圖2)：(1)對(duì)照品稱量過程引入的不確定度(W)；(2)供試品溶液、對(duì)照品溶液配制過程引入的不確定度(V1/V2、VS)；(3)供試品溶液、對(duì)照品溶液峰面積測(cè)定引入的不確定度(AX、AS)。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供該批綠原酸對(duì)照品的純度為 98.3%，但未提供其不確定度的信息，結(jié)合查閱文獻(xiàn)結(jié)果可知，對(duì)照品純度的不確定度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響可忽略不計(jì)，故本文不予評(píng)定。

2.2 量化不確定度分量

圖2 測(cè)量不確定度來源Fig 2 The source of measurement uncertainty

稱量采用減重法進(jìn)行，2次讀數(shù)獨(dú)立而不相關(guān)，故天平的示值誤差應(yīng)計(jì)算2次，所以對(duì)照品稱量過程中引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

將上述分量合成得250 mL單標(biāo)線容量瓶標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=2.79×10-1mL

表1 250 mL容量瓶的重復(fù)量取結(jié)果(n=10)Tab 1 The results of repeated measuring of 250 mL volumetric flask(n=10)

將上述分量合成得5mL單標(biāo)線移液管標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=8.89×10-3mL

將上述分量合成得25mL單標(biāo)線容量瓶標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=2.95×10-2mL

表2 5 mL重復(fù)量取結(jié)果(n=10)Tab 2 The results of repeated measuring of 5 mL volumetric flask(n=10)

表3 25 mL容量瓶的重復(fù)量取結(jié)果(n=10)Tab 3 The results of repeated measuring of 25 mL volumetric flask(n=10)

2.2.4 對(duì)照品溶液重復(fù)性測(cè)試引入的不確定度u(AS) 在測(cè)定峰面積時(shí)，儀器引入的不確定度如電信號(hào)的轉(zhuǎn)換，由于被檢濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于檢測(cè)限，可忽略不計(jì)。對(duì)測(cè)量產(chǎn)生的影響體現(xiàn)在重復(fù)性中。取對(duì)照品溶液在高效液相色譜儀上連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)定結(jié)果為隨機(jī)測(cè)量，u(AS)屬于A類不確定度，應(yīng)用貝塞爾公式法計(jì)算，數(shù)據(jù)見表4。

表4 綠原酸對(duì)照品峰面積的重復(fù)測(cè)定結(jié)果(n=6)Tab 4 The results of repeated measuring of chlorogenic acid(n=6)

2.2.5 供試品溶液峰面積的不確定度u(AX) 同2.2.4，取供試品溶液在高效液相色譜儀上連續(xù)測(cè)定6次，應(yīng)用貝塞爾公式法計(jì)算，數(shù)據(jù)見表5。

表5 供試品峰面積的重復(fù)測(cè)定結(jié)果(n=6)Tab 5 The results of repeated measuring of Jinqinshao Injection

2.2.6 計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 u(CX)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度是測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差的估計(jì)值，是將所有測(cè)量不確定度分量合成為總體方差的正平方根。將上述各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(CX)/CX匯總在表6，計(jì)算合成相對(duì)不確定度：

測(cè)得金芩芍注射液中綠原酸的含量：

=2.96 mg/mL

則合成相對(duì)不確定度為：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(CX)= ucrel(CX)×2.96 mg/mL=0.0075×2.96 mg/mL=0.02 mg/mL

2.2.7 擴(kuò)展不確定度與測(cè)量不確定度報(bào)告 擴(kuò)展不確定度為合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度與包含因子的乘積，U=u(CX)·k=0.02×2=0.04 mg/mL(包含因子k=2，置信區(qū)間為95%)。測(cè)量結(jié)果由測(cè)定值±擴(kuò)展不確定度表示[7]。最終結(jié)果可表示為(2.96±0.04)mg/mL，k=2。

3 討 論

試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定金芩芍注射液中綠原酸的含量。根據(jù)CNAS-GL06：2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》及相關(guān)規(guī)定，并參考相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)高效液相色譜法測(cè)定金芩芍注射液含量的不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過比較各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的大小，可發(fā)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響程度較大的試驗(yàn)環(huán)節(jié)，進(jìn)而重點(diǎn)控制該環(huán)節(jié)的不確定度來源，從而為進(jìn)一步提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性奠定基礎(chǔ)。

試驗(yàn)中，對(duì)照品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為6.71×10-3，屬最大分量；供試品峰面積測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為2.28×10-3，屬第二大分量；供試品取樣體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.78×10-3，屬第三大分量。因而，對(duì)于中藥注射劑的定量檢驗(yàn)中的風(fēng)險(xiǎn)環(huán)節(jié)，需重點(diǎn)關(guān)注天平、高效液相色譜儀及移液管的使用和維護(hù)。

對(duì)具體操作的指導(dǎo)意義有：①對(duì)照品的稱量為毫克級(jí)，稱量會(huì)引起較大的誤差，為減小稱量引入的不確定度，可根據(jù)天平的精度和量程范圍選擇適宜的天平，并根據(jù)所稱樣品的性質(zhì)適當(dāng)增加稱樣量。②應(yīng)加強(qiáng)對(duì)高效液相色譜儀的保養(yǎng)，使其保持穩(wěn)定的狀態(tài)；加強(qiáng)試驗(yàn)過程的控制及標(biāo)準(zhǔn)操作訓(xùn)練，以減少隨機(jī)變化和人為因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。另外應(yīng)盡量確保色譜峰峰面積控制在百萬級(jí)內(nèi)。若色譜峰峰面積超過千萬級(jí)可能會(huì)引入較大的測(cè)定誤差。③玻璃量器中體積越小的量器引入的不確定度越大，建議使試驗(yàn)溫度接近校準(zhǔn)溫度或選用A級(jí)大容量量器來降低誤差。

引入測(cè)量不確定度后，檢測(cè)結(jié)果由單一數(shù)值轉(zhuǎn)變?yōu)楸粶y(cè)值可能分布的區(qū)間范圍，通過“檢測(cè)值±擴(kuò)展不確定度(U)”表示，若“檢測(cè)值±U”不在限值內(nèi)，則檢測(cè)結(jié)果判定為不合格；若在限值內(nèi)，則檢測(cè)結(jié)果判定為合格；若橫跨在限值兩側(cè)，則檢測(cè)結(jié)果判定存在不確定性，具有一定風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。可通過選擇更有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)人員重復(fù)檢驗(yàn)，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[8]。如反復(fù)檢測(cè)驗(yàn)證后，“檢測(cè)值±U”仍橫跨在限值兩側(cè)，比較穩(wěn)妥的辦法是判定為符合規(guī)定的同時(shí)給出風(fēng)險(xiǎn)提示。

試驗(yàn)為高效液相色譜法測(cè)定中藥注射液有效成分含量不確定度評(píng)價(jià)提供了可靠的方法，并為提高中藥注射液含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了參考依據(jù)。

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