陳宏，王博，趙海源*，李金祥，趙博，李莉,王玉紅，崔凱，朱長動(dòng)

(1.吉林冠界生物技術(shù)有限公司，吉林梅河口 135000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，北京 100081)

在禽流感病毒中，部分H5和H7亞型毒株可引起高致病性禽流感。我國是世界上禽類養(yǎng)殖量最大的國家，也是高致病性禽流感的爆發(fā)區(qū)，2015年中國大陸10個(gè)省發(fā)生16起H5高致病性禽流感疫情，造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億元[1]。這就需要大量安全、高效、低成本的禽流感疫苗。目前市場上大部分疫苗仍為雞胚制備[2]，這種疫苗生產(chǎn)需要消耗大量的SPF雞胚，且勞動(dòng)強(qiáng)度大、產(chǎn)量不穩(wěn)定，不利于應(yīng)對大規(guī)模的禽流感疫情爆發(fā)。與傳統(tǒng)雞胚生產(chǎn)方法相比，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感疫苗具有很多優(yōu)勢，如抗原匹配性好，可以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)和縮短生產(chǎn)周期，自動(dòng)化控制程度高，批間差異小等。通過我們的研究證明，禽流感病毒在MDCK傳代細(xì)胞上具有良好的適應(yīng)性，用其培養(yǎng)的禽流感病毒獲得的病毒滴度較高。試驗(yàn)對H5亞型Re-7株病毒在MDCK細(xì)胞中的增殖條件進(jìn)行探索，以期篩選出最適接毒量和最佳收獲時(shí)間，為動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)禽流感疫苗提供了相對穩(wěn)定的參數(shù)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒 MDCK懸浮細(xì)胞系是由吉林冠界生物技術(shù)公司自行馴化；重組禽流感病毒H5亞型Re-7株購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑及耗材 選用培養(yǎng)基為國產(chǎn)無血清全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基；1%雞紅細(xì)胞懸液由吉林冠界生物技術(shù)公司自行制備；檢驗(yàn)用SPF雞胚購自梅里亞公司。

1.3 方法

1.3.1 最適接毒量MOI以及最佳收毒時(shí)間的確定

將重組禽流感病毒H5亞型Re-7株種毒以不同的MOI(10-3、10-2、10-1)分別接種于3臺100 L生物反應(yīng)器(分別命名為1#、2#、3#反應(yīng)器)相同數(shù)量的細(xì)胞中，從接毒后的24 h開始，每隔12 h取樣測其毒價(jià)(HA滴度、TCID50以及EID50)直至收毒并測其毒價(jià)(HA滴度、TCID50以及EID50)。

1.3.2 禽流感病毒在反應(yīng)器中的接種及增殖過程

接種前將3臺100 L反應(yīng)器的細(xì)胞密度都控制在4×106cells/mL左右，細(xì)胞活力控制在95%左右，然后通過無菌的方法將MOI為10-3、10-2、10-1的種毒分別接種至1#、2#、3#反應(yīng)器的細(xì)胞懸液中。從接毒后24 h開始，每隔12 h取樣監(jiān)測活細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞活率，并使用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況。

2 結(jié) 果

2.1 最適接毒量MOI以及最佳收獲時(shí)間

2.1.1 不同的感染復(fù)數(shù)(最適接毒量)對病毒增殖的影響 當(dāng)種毒接入量MOI為10-3時(shí)，由于病毒感染量低而使增殖速度降低，無法達(dá)到較高的血凝價(jià)和毒價(jià)。當(dāng)種毒接入量MOI為10-1時(shí)，由于病毒的感染量過高而使感染過快，造成細(xì)胞在感染的初期過早的死亡，此時(shí)也無法獲得較高的血凝價(jià)和毒價(jià)。而當(dāng)種毒接入量MOI為10-2時(shí)病毒的增殖比較穩(wěn)定，病毒的血凝價(jià)和毒價(jià)較高，血凝價(jià)最高值為1∶1024[3]，每1 mL病毒含量最高達(dá)到107.33TCID50，每0.1 mL病毒含量最高達(dá)到106.83EID50[4]，結(jié)果見表1。

2.2.2 最佳收獲時(shí)間的確定 通過對不同感染復(fù)數(shù)對病毒增殖的研究，確定最適接毒量MOI為10-2，在此接毒量的條件下對最佳收獲時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)分析，當(dāng)接毒后60 h血凝價(jià)達(dá)到1∶1024，每1 mL病毒含量最高達(dá)到107.33TCID50，每0.1 mL病毒含量最高達(dá)到106.83EID50，并且在接毒后72 h毒價(jià)穩(wěn)定在此水平無明顯變化，說明在接毒后60 h為最佳收獲時(shí)間，結(jié)果見圖1。

表1 不同的MOI對病毒增殖的影響(HA、TCID50/mL；EID50/0.1mL)Tab 1 Effects of different MOI on viral proliferation(HA、TCID50/mL, EID50/0.1mL)

圖1 最佳收獲時(shí)間曲線Fig 1 The best harvest time curve

2.2 禽流感病毒在反應(yīng)器中的接種及增殖過程

2.2.1 接毒后的活細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞活力 接毒后隨著時(shí)間的推移，病毒的感染逐步增強(qiáng)，活細(xì)胞數(shù)會(huì)隨之減少，細(xì)胞活率逐漸下降。當(dāng)種毒接入量MOI為10-3時(shí)，由于病毒感染量低細(xì)胞活率下降較慢，病毒的增殖會(huì)受影響。當(dāng)種毒接入量MOI為10-1時(shí)，由于病毒的感染量過高而使感染過快造成細(xì)胞快速死亡，細(xì)胞活率下降較快，病毒的增殖也會(huì)受到影響。而當(dāng)種毒接入量MOI為10-2時(shí)病毒的增殖比較穩(wěn)定，細(xì)胞活率下降的趨勢也較為正常，后期收毒時(shí)也能保持較高的毒價(jià)[5]，結(jié)果見表2。

表2 不同接毒量對接毒后的活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力的影響(cells/mL；%)Tab 2 Effects of the number of living cells and cell viability of different venomous antivirus (cells/mL, %)

2.2.2 接毒后病毒的增殖以及在細(xì)胞上的病變情況 當(dāng)種毒接入量MOI為10-2時(shí)病毒的增殖比較穩(wěn)定，細(xì)胞活率下降的趨勢也較為正常，通過接毒后取樣鏡檢觀察細(xì)胞病變情況可以看出，24 h細(xì)胞病變開始出現(xiàn)，有部分細(xì)胞表面變得粗糙并伴有裂痕。48 h病變十分明顯，部分細(xì)胞破裂，說明此時(shí)病毒出芽釋放比較明顯。72 h細(xì)胞破碎嚴(yán)重，病毒出芽釋放相對完全。結(jié)合接毒后48 h～72 h的測毒情況，設(shè)定在接毒后60 h的收獲時(shí)間是合理的[6]，結(jié)果見圖2。

A. 健康細(xì)胞(400×)A. healthy cells (400×)

B. 24h細(xì)胞病變(400×)B. 24h cell lesion (400×)

C. 48h細(xì)胞病變(200×)C. 48h cell lesion (200×)

D. 72h細(xì)胞病變(200×)D. 72h cell lesion (200×)

3 討 論

利用動(dòng)物傳代細(xì)胞生產(chǎn)禽流感疫苗與使用雞胚苗相比，在產(chǎn)量及疫苗的穩(wěn)定性上都有較為明顯的優(yōu)勢，也在很大程度上降低了由于流感病毒在雞胚上連續(xù)傳代而引起HA基因發(fā)生突變的幾率[7]，使免疫效果更為可靠。隨著MDCK細(xì)胞生產(chǎn)禽流感疫苗推向市場，此疫苗的可靠性也在全國范圍內(nèi)得到了更多的認(rèn)可。

本試驗(yàn)中重組禽流感病毒H5亞型Re-7株接種MDCK細(xì)胞，選取了三種不同的接毒量并在接毒后不同時(shí)間取樣監(jiān)測毒價(jià)，從而最終確定最適接毒量和最佳收毒時(shí)間。在病毒感染復(fù)數(shù)MOI為10-2時(shí)收獲時(shí)毒價(jià)最高，適當(dāng)?shù)牟《窘臃N量可以更好的實(shí)現(xiàn)病毒的增殖[8]。當(dāng)接種量過低和細(xì)胞數(shù)量不匹配，病毒需要經(jīng)過多次循環(huán)復(fù)制，達(dá)到血凝滴度的峰值的時(shí)間延長，病毒生產(chǎn)過程減慢，最終的毒價(jià)也不高[9]。當(dāng)病毒接種量過多時(shí)，細(xì)胞在病毒的感染下很快死亡，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量不具有感染性的不完全病毒顆粒，限制病毒的多循環(huán)感染[10]。

收毒時(shí)間對于病毒培養(yǎng)過程來說也是一個(gè)關(guān)鍵性的參數(shù)，試驗(yàn)在確定接毒量的同時(shí)對于收毒時(shí)間也進(jìn)行了研究，在接毒后60 h毒價(jià)達(dá)到峰值，并且在接毒后72 h毒價(jià)仍穩(wěn)定在此峰值水平，沒有明顯的升高或降低，出于對整個(gè)工藝流程中時(shí)間成本的考慮，收獲的最佳時(shí)間應(yīng)為接毒后60 h左右。

利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行禽流感疫苗生產(chǎn)的技術(shù)已日趨成熟，此種技術(shù)在國內(nèi)外動(dòng)保行業(yè)正在被廣泛推廣[11]。目前我們的生物反應(yīng)器規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)水平已經(jīng)達(dá)到能夠放大至6000 L自動(dòng)控制的規(guī)模。試驗(yàn)對重組禽流感病毒H5亞型Re-7株的最適接毒量和最佳收毒時(shí)間進(jìn)行了研究，確定最適接毒量MOI為10-2、最佳收獲時(shí)間為60 h，在100 L生物反應(yīng)器中重復(fù)驗(yàn)證，獲得穩(wěn)定的試驗(yàn)結(jié)果，病毒血凝價(jià)達(dá)到1∶1024，每1 mL病毒含量達(dá)到107.33TCID50，每0.1 mL病毒含量達(dá)到106.83EID50。研究為禽流感疫苗的生物反應(yīng)器的規(guī)?；a(chǎn)提供了可靠的理論依據(jù)。

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