劉峙嶸，劉大前，王長福，王 云，陳 帥

(1.東華理工大學(xué)省部共建核資源與環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，江西南昌 330013；2.東華理工大學(xué)核科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330013)

秸稈通常指的是農(nóng)作物在收獲籽實(shí)后剩余的莖葉部分，數(shù)量巨大，并隨著糧食產(chǎn)量的加大而逐年增長。由于秸稈數(shù)量巨大，腐解速率緩慢，攜帶病菌，而且秸稈難消化、蛋白質(zhì)含量低、木質(zhì)素和硅含量較高，不適合做動物飼料，因此如何處理這些數(shù)量巨大的秸稈成為目前一大難題。很多國家通常直接將秸稈進(jìn)行焚燒處理，這又產(chǎn)生了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，并且對公眾健康產(chǎn)生了威脅。因此，作為豐富的可再生資源，秸稈的合理開發(fā)和利用對全球能源危機(jī)的緩解和環(huán)境污染的改善有著重要的意義。秸稈中含有大量的有機(jī)質(zhì)和微量元素，將其作為還田肥料可以有效地提高土壤肥力，對改善我國養(yǎng)分失調(diào)的土壤有著深遠(yuǎn)的意義。目前，秸稈還田技術(shù)在發(fā)達(dá)國家已經(jīng)十分成熟，普及率相對較高，并且獲得了不錯(cuò)的效果[1]。正常條件下，秸稈腐解速率緩慢，養(yǎng)分釋放量低。還田時(shí)施用腐稈劑可以有效增加微生物數(shù)量，加速秸稈腐解，提高養(yǎng)分釋放量，并且對農(nóng)作物產(chǎn)量的增加有顯著促進(jìn)效果[2]。

秸稈主要由植物的細(xì)胞壁物質(zhì)即木質(zhì)素、纖維素和半纖維素構(gòu)成，這3種物質(zhì)通過化學(xué)鍵相互緊貼在一起，形成一種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致秸稈很難被降解。自然界中的微生物種類繁多，其中不乏一些能將纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解的種類，這些微生物代謝所產(chǎn)生的一系列酶能將秸稈粗纖維中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等大分子碳水化合物降解為低分子的單糖或多糖[3]。但是單一菌種分泌的酶系有限，秸稈很難在1種菌種下完全降解，需要多種微生物產(chǎn)生多種酶系來協(xié)同完成降解[4]。腐稈劑是一種高效的微生物制劑[5]，其中富含各種能分解細(xì)胞壁木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的微生物[6]，能很好地對秸稈進(jìn)行降解。傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)具有無損、快速、靈敏度高等特點(diǎn)，近年來被廣泛用于農(nóng)作物秸稈腐解研究。本試驗(yàn)采用傅里葉變換紅外光譜法，通過測定添加腐稈劑后水稻秸稈樣品中纖維素酶、半纖維素酶的活性，微生物的數(shù)量以及木質(zhì)纖維素三組分的含量，探討了腐稈劑快速分解水稻秸稈的生物化學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所選取的秸稈來自江西省南昌市新建縣某稻田，屬于第二季水稻的秸稈，采用抽選的方法從一片稻田的水稻中抽取適量作為研究對象。將新鮮水稻秸稈放置在陽光下自然風(fēng)干半個(gè)月，風(fēng)干后將秸稈剪至5 cm左右，用多功能粉碎機(jī)將其粉碎，過40目篩，放置在干燥箱中，105 ℃下烘干備用。試驗(yàn)所用腐稈劑包括特定的細(xì)菌、真菌和放線菌組合，由上海聯(lián)業(yè)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

主要試劑：無水醋酸鈉、冰醋酸、3，5-二硝基水楊酸、木糖、四水合酒石酸鉀鈉、重蒸苯酚、無水亞硫酸鈉、木聚糖、無水葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、二水合乙二胺四乙酸二鈉、十水合硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、乙二醇乙醚、無水磷酸氫二鈉，分析純，均由國藥集團(tuán)化學(xué)股份有限公司提供。

主要儀器：DZ-2BCⅡ型真空干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司)、Nicolet IS5型傅里葉變換紅外光譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)、SXL-1216型程控箱式電爐(馬弗爐)(杭州市卓馳儀器有限公司)、721型分光光度計(jì)(天津冠澤科技有限公司)、SHA-B型恒溫水浴振蕩器(常州國華電器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)通過測定被腐稈劑腐解的水稻秸稈中纖維素酶活性和半纖維素酶活性，細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量的變化和木質(zhì)纖維素三組分含量的變化，再加以空白對照，分析腐稈劑在加速水稻秸稈腐解過程中的影響和作用途徑。在一系列容量為250 mL的錐形瓶中加入5 g秸稈樣品，然后加入0.05 g腐稈劑、1 mL尿素溶液(50 g/L)和pH值為7的水。用保鮮膜封口，放入恒溫箱中，30 ℃下培養(yǎng)。每隔3 d取出1個(gè)樣品，1 g用于酶活力的測定，1 g用于微生物數(shù)量的測定。剩下的樣品在105 ℃下干燥，測含水量，用于樣品干質(zhì)量計(jì)算，干燥后的樣品用于木質(zhì)纖維素三組分的測定和紅外光譜分析。

1.3 分析方法

1.3.1 纖維素酶活力的測定 纖維素酶活力的測定采用DNS(3，5-二硝基水楊酸)顯色法[7]，主要檢測內(nèi)切葡聚糖酶。

待測酶液的制備：準(zhǔn)確稱取1 g秸稈樣品于100 mL錐形瓶中，加醋酸-醋酸鈉緩沖液20 mL，放入搖床中200 r/min浸提1 h。浸提完畢后略靜置，將上清液置于離心管中，在 10 000 r/min 下離心10 min。離心后的上清液根據(jù)酶活力大小，稀釋至適當(dāng)濃度，即為待測酶液。

樣品的測定：取1% CMC溶液3 mL和待測酶液1 mL于試管中，置于恒溫水浴鍋中50 ℃下糖化30 min；空白樣取1% CMC溶液3 mL和待測酶液1 mL于試管中，沸水浴 10 min 使酶失活，再置于恒溫水浴鍋中50 ℃下糖化30 min。糖化后立即沸水浴煮10 min使酶失活，得糖化液，冷卻后加入3 mL DNS試劑，再沸水浴10 min，冷卻后用25 mL容量瓶加水定容?？瞻讟佑糜谡{(diào)零，用分光光度計(jì)測樣品在波長為550 nm下的吸光度。本試驗(yàn)以1 min內(nèi)生成1 μg葡萄糖量所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)，計(jì)算公式如下：

(1)

式中：C表示測得的葡萄糖濃度，mg/mL；N表示酶液稀釋總倍數(shù)；t表示反應(yīng)時(shí)間，min；V表示樣品的體積，mL；m表示樣品干質(zhì)量，g。

1.3.2 半纖維素酶活力的測定 半纖維素酶活力的測定同樣采用DNS(3，5-二硝基水楊酸)顯色法，主要檢測木聚糖酶活力。取1%木聚糖溶液3 mL和待測酶液1 mL于試管中，置于恒溫水浴鍋中50 ℃下糖化60 min；空白樣取1%木聚糖溶液3 mL和待測酶液1 mL于試管中，沸水浴10 min使酶失活，再置于恒溫水浴鍋中50 ℃下糖化30 min。糖化后立即于沸水浴中煮10 min使酶失活，得糖化液，冷卻后加入 3 mL DNS試劑，再沸水浴10 min，冷卻后用25 mL容量瓶加水定容。空白樣用于調(diào)零，用分光光度計(jì)測樣品在波長為550 nm下的吸光度。本試驗(yàn)以1 min內(nèi)生成1 μg木糖量所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)，計(jì)算公式如下：

(2)

式中：C表示測得的木糖濃度，mg/mL；N表示酶液稀釋總倍數(shù)；t表示反應(yīng)時(shí)間，min；V表示樣品的體積，mL；m表示樣品干質(zhì)量，g。

1.3.3 微生物群落的演替 用稀釋平板計(jì)數(shù)方法[6]分別計(jì)算細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量。稱取1 g秸稈樣品置于 250 mL 錐形瓶中，加入99 mL水，置于搖床中振蕩5 min使秸稈樣品均勻分散在稀釋液中成為稻稈粉末懸液。將懸濁液逐級稀釋得到不同稀釋度的溶液，待測。

1.3.4 木質(zhì)纖維素三組分的測定 秸稈樣品中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測定采用差重法[8]。準(zhǔn)確稱取1 g干燥后的秸稈樣品于250 mL錐形瓶中，加入100 mL中性洗滌劑，置于恒溫鍋中100 ℃下油浴1 h，用熱水洗滌至無中性洗滌劑，再用丙酮洗滌2次，將殘?jiān)糜诟稍锵鋬?nèi)105 ℃干燥至恒質(zhì)量m1(g)；將殘?jiān)D(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶內(nèi)，加入70 mL 2 mol/L鹽酸，置于恒溫鍋中100 ℃下油浴1 h，用水洗滌至中性，再依次用適量的95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌2次，將殘?jiān)诟稍锵渲?05 ℃下干燥至恒質(zhì)量m2(g)；將殘?jiān)D(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶內(nèi)，加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72%的冷硫酸，室溫降解 4 h 后加90 mL水，24 h后用水洗滌殘?jiān)羛H值為6.5，105 ℃干燥至恒質(zhì)量m3；將殘?jiān)糜谯釄逯?，于馬弗爐中550 ℃下灼燒4 h，剩余質(zhì)量m4。計(jì)算三組分含量，公式如下：

(3)

(4)

(5)

式中：m0表示秸稈初始質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 腐解前后秸稈樣品紅外光譜分析

秸稈樣品腐解前后的紅外譜圖如圖1所示。

對比秸稈樣品腐解前后的紅外譜圖可知，腐解后的秸稈樣品在3 300～3 500 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度比腐解前的明顯減弱，這表明秸稈腐解后所含酚羥基或者醇羥基有所減少，根據(jù)吸收峰的歸屬分析，這主要是秸稈中纖維素被降解，其中的羥基含量降低；2 920 cm-1處吸收峰減弱，說明腐解后秸稈中的碳水化合物和脂肪族化合物被降解，導(dǎo)致部分甲基和亞甲基被降解；1 610 cm-1處吸收峰強(qiáng)度減弱，表示有機(jī)羧酸被降解，含量減少；1 520 cm-1處吸收峰強(qiáng)度略有減弱，說明酰胺中的N—H鍵被破壞，這表示氨基酸被分解；1 430 cm-1處吸收峰的強(qiáng)度有所減弱，這表明秸稈中的脂肪族化合物、木質(zhì)素以及碳水化合物被降解[9]。1 380 cm-1處吸收峰強(qiáng)度減弱，說明脂肪類化合物被大量分解，氨基的含量大量減少；1 320 cm-1處吸收峰的強(qiáng)度減弱，說明木質(zhì)素被降解，C—O鍵減少；1 230 cm-1處吸收峰強(qiáng)度減弱，說明纖維素被降解，含量降低，C—O鍵、Si—O鍵減少。

2.2 腐稈劑對水稻秸稈腐解過程中酶的影響

腐解過程是微生物將復(fù)雜有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化成簡單有機(jī)化合物和無機(jī)物的過程，其中的關(guān)鍵物質(zhì)就是微生物產(chǎn)生的水解酶，腐解反應(yīng)礦化進(jìn)程和強(qiáng)度都由酶的活性直接反映[10]。CMC酶和木聚糖酶都是水解酶的一種，在腐解過程中起著重要的作用。試驗(yàn)所得腐解過程中CMC酶和木聚糖酶的變化曲線見圖2、圖3。

從圖2可以看出，添加腐稈劑的秸稈樣品中CMC酶活在腐解前期上升迅速，16 d出現(xiàn)最高酶活9.01 U/g，之后酶活開始急速降低?？瞻讟又械拿富钌仙徛?，16 d出現(xiàn)最高酶活5.62 U/g，之后酶活緩慢下降。由圖3可知，添加腐稈劑的秸稈樣品中木聚糖酶的活性變化趨勢與CMC酶相似，為先升高后下降，最高酶活出現(xiàn)在16 d，為12.25 U/g?？瞻讟又心揪厶敲富畹淖兓厔葺^緩慢，最高酶活出現(xiàn)在16 d，為 7.96 U/g。因此，無論是CMC酶活還是木聚糖酶活都隨著腐解進(jìn)程先升高后下降，造成這樣的原因可能是腐解前期營養(yǎng)物質(zhì)充足，微生物代謝旺盛，產(chǎn)酶能力強(qiáng)；而隨著時(shí)間增長，營養(yǎng)物質(zhì)開始供應(yīng)不足，微生物產(chǎn)酶能力降低。添加腐稈劑后的樣品中CMC酶和木聚糖酶的最高酶活和平均酶活都明顯高于空白樣，說明添加腐稈劑能夠顯著提高水稻秸稈腐解各個(gè)階段的CMC酶活和木聚糖酶活[11]，從而促進(jìn)纖維素和半纖維素的快速降解。

2.3 腐稈劑對水稻秸稈腐解過程中微生物數(shù)量的影響

微生物代謝在水稻秸稈腐解過程中起著重要作用，因此，對腐解過程中微生物數(shù)量變化進(jìn)行分析十分必要。本試驗(yàn)測得的腐解過程中微生物變化曲線見圖4、圖5、圖6。

從圖4可以看出，添加腐稈劑的秸稈樣品在整個(gè)腐解階段的細(xì)菌數(shù)量都高于空白樣，這說明腐稈劑在整個(gè)腐解過程中都促進(jìn)了細(xì)菌生長。從圖5可以看出，添加腐稈劑的秸稈樣品的真菌數(shù)量在腐解開始時(shí)略高于空白樣，12 d后數(shù)量優(yōu)勢開始變得越來越明顯，這說明了腐稈劑對腐解過程中真菌數(shù)量的提升主要體現(xiàn)在腐解后期。從圖6可以看出，添加腐稈劑的樣品中放線菌數(shù)量在腐解前期就有一定的優(yōu)勢，雖然在4～8 d優(yōu)勢開始縮小，但8 d后優(yōu)勢又開始擴(kuò)大，并持續(xù)保持一定優(yōu)勢，這說明腐稈劑對整個(gè)腐解過程中放線菌的數(shù)量有一定的促進(jìn)作用[12]。

2.4 腐稈劑對水稻秸稈腐解過程中木質(zhì)纖維素三組分降解的影響

纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是水稻秸稈的主要成分，對腐解過程中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解進(jìn)行分析是很有必要的。本試驗(yàn)所得腐解過程中木質(zhì)纖維素三組分降解動態(tài)見圖7、圖8、圖9。

從圖7可以看出，無論是否添加腐稈劑，秸稈樣品腐解過程中纖維素的降解速率都是先慢后加快再變慢。這是因?yàn)樵诩?xì)胞壁結(jié)構(gòu)中，纖維素被木質(zhì)素和半纖維素緊緊纏繞，很難降解；但隨著腐解的進(jìn)行，半纖維素和木質(zhì)素被部分降解，被包裹的纖維素漸漸裸露出來，降解速度開始加快；腐解后期由于營養(yǎng)物質(zhì)不足導(dǎo)致微生物產(chǎn)酶下降[13]，導(dǎo)致降解速率下降。這與腐解過程中CMC酶動態(tài)反映的結(jié)果基本一致。添加腐稈劑的樣品腐解24 d纖維素的降解率為35.24%，比空白樣高出了9.4百分點(diǎn)，說明了腐稈劑的添加在一定程度上促進(jìn)了纖維素的降解。從圖8可以看出，腐解過程中半纖維素在腐解前期就表現(xiàn)出了較快的降解速率，但隨著時(shí)間增長腐解速率開始下降，這與腐解過程中木聚糖酶動態(tài)變化反映的情況基本一致。腐解24 d，添加腐稈劑的樣品半纖維素降解率為 38.36%，比空白樣高出了12.88百分點(diǎn)，說明腐稈劑的添加在一定程度上促進(jìn)了半纖維素的降解。從圖9可以看出，在腐解前8 d添加腐稈劑的樣品中木質(zhì)素降解率與空白樣之間并沒有明顯差異，8 d后才表現(xiàn)出更強(qiáng)的降解能力。腐解24 d添加腐稈劑的樣品中木質(zhì)素降解率僅為14.35%，但比空白樣高出了5.14百分點(diǎn)，這說明了雖然腐稈劑的添加促進(jìn)了木質(zhì)素的降解，但降解率還是相對較低。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過測定被腐稈劑腐解的水稻秸稈中纖維素酶、半纖維素酶的活性，微生物的數(shù)量以及木質(zhì)纖維素三組分的含量，并對比腐解前后秸稈樣品的紅外光譜圖，探究了腐稈劑快速分解水稻秸稈的機(jī)制，所得結(jié)果有：對比腐解前后秸稈的紅外譜圖發(fā)現(xiàn)，腐解后的秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等碳水化合物發(fā)生分解，使羥基和亞甲基基團(tuán)減少，同時(shí)也表明酚類化合物被氧化成醌類物質(zhì)；秸稈中的蛋白質(zhì)和氨基酸分解后生成酰胺類化合物、硝酸鹽和銨鹽。腐稈劑的添加能顯著提升水稻秸稈腐解過程中CMC酶和木聚糖酶的活性，并且酶的活性都隨著時(shí)間的增長先升高后降低。腐稈劑中的微生物組合能根據(jù)水稻秸稈腐解的不同階段起到不同的作用來影響降解過程。腐稈劑的添加能促進(jìn)水稻秸稈腐解過程中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解，但木質(zhì)素降解率相對較低。此外，秸稈中各活性成分的降解速率和降解百分比還有待提高，腐稈劑的最佳腐解條件還需進(jìn)一步研究。

[1]Bessou C，F(xiàn)erchaud F，Gabrielle B，et al.Biofuels，greenhouse gases and climate change：a review[J].Agronomy for Sustainable Development，2011，31(1)：1-79.

[2]楊振興，周懷平，關(guān)春林，等.秸稈腐熟劑在玉米秸稈還田中的效果[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(4)：354-357.

[3]Lv Y C，Li N，Gong D C，et al.The effect of temperature on the structure and function of a cellulose-degrading microbial community[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，168(2)：219-223.

[4]Sharma A，Sharma R，Arora A，et al.Insights into rapid composting of paddy straw augmented with efficient microorganism consortium[J].International Journal of Recycling of Organic Waste in Agriculture，2014(3)：54.

[5]劉 剛，莊義慶，楊敬輝，等.腐稈劑與秸稈配施對稻田N2O排放的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34(3)：736-741.

[6]Simmons C W，Reddy A P，D’Haeseleer P，et al.Metatranscriptomic analysis of lignocellulolytic microbial communities involved in high-solids decomposition of rice straw[J].Biotechnology for Biofuels，2014(7)：495.

[7]張全國，張志萍，趙民善，等.秸稈制氫過程中纖維素酶酶活測定方法研究[J].熱科學(xué)與技術(shù)，2011，10(2)：128-132.

[8]Rose M T，Deaker R，Potard S，et al.The survival of plant growth promoting microorganisms in peat inoculant as measured by selective plate counting and enzyme-linked immunoassay[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，27(7)：1649-1659.

[9]張紅漫，鄭榮平，陳敬文，等.NREL法測定木質(zhì)纖維素原料組分的含量[J].分析試驗(yàn)室，2010，29(11)：15-18.

[10]陶 軍，張樹杰，焦加國，等.蚯蚓對秸稈還田土壤細(xì)菌生理菌群數(shù)量和酶活性的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，30(5)：1306-1311.

[11]Yeasmin S，Kim C H，Park H J，et al.Cell surface display of cellulase activity-free xylanase enzyme on saccharomyces cerevisiae EBY100[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2011，164(3)：294-304.

[12]張 紅，呂家瓏，曹瑩菲，等.不同植物秸稈腐解特性與土壤微生物功能多樣性研究[J].土壤學(xué)報(bào)，2014，51(4)：743-752.

[13]Haft R J，Gardner J G，Keating D H.Quantitative colorimetric measurement of cellulose degradation under microbial culture conditions[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2012，94(1)：223-229.