邢效瑞，崔京春，郭海勇，錢愛東，楊閩楠

(1.西南醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，四川瀘州 646000；2.大連民族大學生命科學學院，遼寧大連 116600；3.吉林師范大學生命科學學院，吉林四平 136000；4.吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春 130118)

榆耳為肉紅膠韌革菌(Gloeostereumincarnatum)的子實體，又稱榆蘑[1-2]，是我國傳統(tǒng)的藥食兼用真菌，多生長在榆樹的枯樹干或樹洞處，主要分布于我國東北部地區(qū)及日本的北海道地區(qū)，在《本草綱目》[3]等書中多有記載，民間流傳使用榆耳水煎液治療紅白痢疾、腹瀉、腸炎等疾病。我國關于榆耳的研究起步較晚，主要集中在榆耳的分類分布、理化特性和生物學特征等方面。目前，液體深層發(fā)酵技術已成為藥用真菌資源開發(fā)的重要手段，具有廣泛的應用價值。目前，國內外的研究認為，榆耳發(fā)酵上清液具有抑菌[4]、抗炎、抗氧化性、抗腫瘤、免疫增強[5]等多種生物學活性。本試驗對榆耳G930菌種的發(fā)酵上清液體外抑菌效果及抑菌效果穩(wěn)定性、榆耳發(fā)酵液多糖的免疫增強作用進行初步研究，以期為榆耳發(fā)酵產物的市場化應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 榆耳G930菌種，由吉林農業(yè)大學菌物研究中心提供；指示菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌標準株(EscherichiacoliATCC 25922)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母桿菌(Saccharomycescerevisiae)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)，均由大連吉翔農業(yè)科技有限公司研究中心提供；指示菌沙門氏菌(Salmonella)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)、大腸桿菌O24(EscherichiacoliO24)，均由西南醫(yī)科大學微生物實驗室提供。

1.1.2 試驗動物 6～8周齡SPF級BALB/c健康雌鼠、2～3 kg 成年健康豚鼠，均購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 榆耳發(fā)酵培養(yǎng)基 榆耳發(fā)酵培養(yǎng)基由4.600%玉米淀粉、1.600%黃豆粉、0.010%磷酸氫二鉀、0.030%磷酸二氫鉀、0.001%硫酸錳、0.001%硫酸鋅、0.03%硫酸鎂、0.100 mg/mL 維生素B1組成，pH值為5.0～5.5，高壓蒸汽滅菌后，4 ℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3.2 各指示菌培養(yǎng)基 各指示菌培養(yǎng)基參照文獻[6]中所述方法及市場在售的培養(yǎng)基使用說明進行配制，高壓蒸汽滅菌后，4 ℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3.3 馬鈴薯液體培養(yǎng)基 馬鈴薯液體培養(yǎng)基由20.00%馬鈴薯、2.00%葡萄糖、0.03%硫酸鎂、0.20%磷酸二氫鉀、10.00 mg/100 mL 維生素B1組成，pH值自然，高壓蒸汽滅菌后，4 ℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 主要試驗試劑 注射用氨芐西林鈉(AMP)，購自哈爾濱制藥三廠；刀豆蛋白A(ConA)，購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液，購自美國Gibco公司；雞紅細胞懸液、豚鼠血清、靈芝多糖溶液，由筆者所在實驗室自制。

1.1.5 主要試驗儀器 紫外分光光度計，購自美國Unico公司；微量移液器，購自美國Thermo公司；超凈工作臺，購自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，購自上海智誠分析儀器制造公司；光學顯微鏡，購自日本Olympus公司；臺式高速離心機，購自德國Osterode公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 榆耳發(fā)酵上清液的制備 將4 ℃保藏的榆耳G930斜面菌種接入已滅菌的馬鈴薯液體培養(yǎng)基中活化，于26 ℃、120 r/min搖床中恒溫培養(yǎng)10 d?；罨蟮挠芏N再按 10 % 的接種量接入已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26 ℃、120 r/min 搖床中發(fā)酵培養(yǎng)7 d，制備得到榆耳發(fā)酵上清液。無菌條件下過濾后得到榆耳發(fā)酵上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 榆耳發(fā)酵上清液抑菌譜的測定及理化因素對其體外抑菌作用的影響

1.2.2.1 榆耳發(fā)酵上清液抑菌譜的測定 榆耳發(fā)酵上清液抑菌譜的測定試驗采用杯碟法，將已經制備好的指示菌懸液稀釋為1×106CFU/mL。制作指示菌培養(yǎng)基平板，將牛津杯(10 mm×8 mm×6 mm)平放在培養(yǎng)基上，在牛津杯中加入100 μL/孔試驗樣品，同時設置AMP(10 μg/孔)和空白發(fā)酵培養(yǎng)基為對照組。37 ℃培養(yǎng)24 h后取出，測定抑菌圈的直徑。

1.2.2.2 榆耳發(fā)酵上清液的體外抑菌活性的熱穩(wěn)定性檢測 取適量的榆耳發(fā)酵上清液，分別測定其在-20、4、37、60、100、121 ℃及室溫(20～25 ℃)等溫度時的抑菌活性，發(fā)酵上清液在-20、4 ℃及室溫的條件下分別保存1周，其余溫度下保存10 min。采用杯碟法，以金黃色葡萄球菌為指示菌，以AMP(10 μg/孔)和空白發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照組進行試驗并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2.3 榆耳發(fā)酵上清液的體外抑菌活性的pH值穩(wěn)定性檢測 取適量榆耳發(fā)酵上清液，用1 mol/L磷酸和 1 mol/L 氫氧化鈉將榆耳發(fā)酵上清液的pH值分別調至1～9。采用杯碟法，以金黃色葡萄球菌作為指示菌，以AMP(10 μg/孔)和不同pH值的空白發(fā)酵培養(yǎng)基為對照組進行試驗并記錄數(shù)據(jù)。

1.3 榆耳發(fā)酵液多糖的免疫增強作用

1.3.1 榆耳發(fā)酵液多糖的粗提 將榆耳發(fā)酵上清液在60 ℃減壓蒸餾，10倍體積濃縮；使用乙醇沉淀法提取粗多糖后，再應用Sevage法除蛋白，得到發(fā)酵液多糖溶液，采用苯酚硫酸法測定榆耳發(fā)酵液的多糖含量。

1.3.2 試驗分組及給藥方式 6～8周齡SPF級BALB/c雌鼠小鼠100只，體質量為(17±2)g，口服給藥，每天給藥1次，每次灌服劑量為0.2 mL/只，連續(xù)給藥21 d，禁食2 h開始試驗。試驗分組的詳細信息如表1所示。

表1 榆耳發(fā)酵液多糖的免疫增強作用試驗分組

1.3.3 小鼠脾臟指數(shù)的測定 從各試驗組中隨機選取5只小鼠，稱質量，處死小鼠，無菌取脾臟后稱脾的質量，計算脾臟指數(shù)，單位mg/g。脾臟指數(shù)=小鼠脾的質量/小鼠體質量。

1.3.4 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的試驗 從各試驗組中隨機選取5只供試小鼠，腹腔注射1 mL 20%壓積雞紅細胞懸液，輕揉腹部。30 min后處死小鼠，向腹腔注射2 mL無菌生理鹽水，吸取1 mL腹腔洗液，滴3～4滴于載玻片上，37 ℃ 保濕溫育30 min后，瑞氏染液染色，油鏡下計數(shù)并計算腹腔巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬率=吞噬紅細胞的巨噬細胞數(shù)量/100×100%；吞噬指數(shù)=被100個巨噬細胞吞噬的紅細胞數(shù)量/100。

1.3.5 小鼠血清溶血素試驗 在各試驗組內隨機選取10只小鼠，腹腔皮下注射1 mL 10%雞紅細胞懸液，3 d后眼球采血，制備小鼠血清；取1 mL稀釋100倍的小鼠血清加入5%雞紅細胞懸液中，再加0.1 mL 10%補體，以不加補體作空白對照，于37 ℃反應30 min，冰水內終止反應，1 000 r/min離心5 min，在540 nm波長處測定吸光度并計算血清樣品的溶血素水平。樣品溶血素水平=樣品吸光度÷雞紅細胞半數(shù)溶血時的吸光度×稀釋倍數(shù)。

1.3.6 ConA誘導小鼠淋巴細胞轉化試驗(體內法) 在各試驗組內隨機選取5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.3 mg ConA，正常飼養(yǎng)3 d后，尾部取血法采集外周血，加入抗凝劑。取1小滴抗凝血涂片，自然干燥。瑞氏染液染色后，油鏡下觀察并計算淋巴細胞的轉化率：轉化率=轉化的淋巴細胞數(shù)量/血液中總的淋巴細胞數(shù)量×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)均用“平均數(shù)±標準差”表示，利用SPSS 19.0軟件對結果進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗平均值的成對二樣本分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 榆耳發(fā)酵上清液抑菌譜的測定及理化因素對其體外抑菌作用的影響

2.1.1 榆耳發(fā)酵上清液的抑菌譜 由表2可知，榆耳發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性最強，抑菌直徑為18.5 mm；榆耳發(fā)酵上清液對枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的抑菌直徑分別為13.2、10.5 mm，對大腸桿菌標準株、大腸桿菌O24和沙門氏菌的抑菌直徑分別為11.7、9.5、11.0 mm，對肺炎克雷伯菌和多殺性巴氏桿菌的抑菌直徑分別為9.0、8.5 mm；榆耳發(fā)酵上清液對釀酒酵母菌無抑制作用。以上試驗結果表明，榆耳G930菌種的發(fā)酵上清液對革蘭氏陽性菌敏感，對革蘭氏陰性菌不敏感，對腸道致病菌的體外抑制作用強于對呼吸系統(tǒng)致病菌的體外抑制作用。

表2 榆耳發(fā)酵上清液體外抑菌試驗結果

注：牛津杯外徑為8.0 mm，“-”表示樣品對指示菌無抑制作用；空白對照培養(yǎng)基對指示菌均無抑制作用。

2.1.2 溫度對榆耳發(fā)酵上清液體外抑菌作用的影響 AMP處理組的抑菌直徑為20.0 mm。由圖1可知，-20、4 ℃保存的榆耳發(fā)酵上清液與常溫保存的榆耳發(fā)酵上清液的體外抑菌活性沒有明顯差異，抑菌直徑均為18.0 mm。37 ℃保存的榆耳發(fā)酵上清液的抑菌直徑為17.5 mm。60、100 ℃保存的榆耳發(fā)酵上清液的抑菌直徑均為16.0 mm。經過121 ℃高壓處理10 min的發(fā)酵上清液的抑菌活性稍有下降。結果表明，榆耳G930菌種的發(fā)酵上清液具有良好的熱穩(wěn)定性，易于保存。

2.1.3 pH值對榆耳發(fā)酵上清液體外抑菌作用的影響 當pH值為1時，陰性對照組的抑菌直徑為14.0 mm，陽性對照組的抑菌直徑為20.5 mm。由圖2可知，當榆耳發(fā)酵上清液的pH值為1時，其體外抑菌直徑最大，為26.0 mm；榆耳發(fā)酵上清液的pH值為2～7時，其抑菌直徑無明顯差異，為17.0～19.0 mm；當榆耳發(fā)酵上清液的pH值為8時，其抑菌直徑為11.0 mm；當榆耳發(fā)酵上清液的pH值為9時，其抑菌直徑為0，體外抑菌活性喪失。結果表明，榆耳G930菌種的發(fā)酵上清液在堿性環(huán)境中會失去體外抑菌活性。

2.2 榆耳發(fā)酵液多糖的免疫增強作用

2.2.1 小鼠脾臟指數(shù) 由表3可知，組2、組3小鼠的脾臟指數(shù)與陰性對照組小鼠的脾臟指數(shù)差異顯著(P<0.05)；組1小鼠的脾臟指數(shù)與陰性對照組小鼠的脾臟指數(shù)無顯著性差異，組2、組3小鼠的脾臟指數(shù)與陽性對照組小鼠的脾臟指數(shù)無顯著性差異。綜合考慮，飼喂小鼠榆耳G930菌種發(fā)酵上清液多糖的最佳劑量為5 mg/d，此時可以明顯增加小鼠的脾臟指數(shù)。

2.2.2 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗 由表4可知，組1的吞噬率與陰性對照組的吞噬率差異顯著(P<0.05)，組2、組3的吞噬率與陰性對照組的吞噬率差異極顯著(P<0.01)。組1的吞噬指數(shù)與陰性對照組的吞噬指數(shù)差異顯著(P<0.05)，組2、組3的吞噬指數(shù)與陰性對照組的吞噬指數(shù)差異極顯著(P<0.01)。就吞噬率和吞噬指數(shù)而言，試驗組與陽性對照組無顯著性差異，組2與組3無顯著性差異。綜合考慮，飼喂小鼠榆耳G930菌種發(fā)酵上清液多糖的最佳劑量為 5 mg/d，此時可以提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力，進而提高機體的非特異性免疫水平。

表3 小鼠脾臟指數(shù)

注：“*”“**”分別表示與陰性對照組相比差異顯著(P<0.05)、差異極顯著(P<0.01)。下表同。

表4 巨噬細胞吞噬雞紅細胞的試驗結果

2.2.3 血清溶血素試驗 由表5可知，3個試驗組的溶血素水平與陰性對照組的溶血素水平相比均差異極顯著(P<0.01)，組2、組3的溶血素水平與陽性對照組的溶血素水平相比差異顯著(P<0.05)，試驗組1與試驗組2、組3差異顯著(P<0.05)，試驗組2與試驗組3無顯著性差異。結果表明，榆耳G930菌種發(fā)酵上清液多糖可以提高小鼠血清溶血素水平，進而提高機體體液免疫水平。綜合考慮，確定榆耳發(fā)酵上清液多糖的最佳飼喂劑量為5 mg/d。

表5 血清溶血素試驗

2.2.4 ConA誘導小鼠淋巴細胞轉化試驗(體內法) 由表6可知，組1小鼠的淋巴細胞轉化率與陰性對照組的無顯著性差異，組2、組3小鼠的淋巴細胞轉化率與陰性對照組的差異顯著(P<0.05)，組2、組3小鼠的淋巴細胞轉化率與陽性對照組的差異顯著(P<0.05)，組2與組3小鼠的淋巴細胞轉化率無顯著性差異。結果表明，當飼喂小鼠榆耳G930菌種發(fā)酵液多糖的劑量為5、10 mg/d時，可以提高小鼠細胞的免疫水平。綜合考慮，確定榆耳發(fā)酵上清液多糖的最佳飼喂劑量為5 mg/d。

表6 ConA誘導淋巴細胞轉化試驗

3 結論與討論

3.1 榆耳發(fā)酵上清液抑菌譜的測定及理化因素對其體外抑菌作用的影響

人們一直認為榆耳在治療腹瀉方面有其獨特的藥用價值，針對榆耳發(fā)酵上清液抑菌譜的研究一直不夠深入和系統(tǒng)。本研究選用畜禽生產中常見的致病菌及腸道益生菌作為指示菌，研究榆耳G930菌種液體發(fā)酵上清液的抑菌譜。結果表明，榆耳發(fā)酵上清液對革蘭氏陽性菌的體外抑制作用強于對革蘭氏陰性菌的體外抑制作用，與崔京春等的研究結果[7]一致，表明榆耳發(fā)酵上清液的體外抑菌作用在不同種屬之間差異不明顯。同時也發(fā)現(xiàn)，榆耳發(fā)酵上清液對腸道致病菌的抑制作用強于對呼吸系統(tǒng)致病菌的抑制作用，民間常用榆耳水煎液治療痢疾，其發(fā)酵上清液中可能含有作用于腸道致病菌的抑菌物質。對榆耳發(fā)酵上清液進行理化處理后發(fā)現(xiàn)，榆耳發(fā)酵上清液中的抑菌物質具有良好的熱穩(wěn)定性和耐酸性，表明其易于保存并可以通過動物的消化系統(tǒng)到達機體作用的部位。以上結論充分表明，榆耳發(fā)酵產物具有作為治療動物腹瀉藥物進行開發(fā)的巨大潛力。本試驗僅對榆耳發(fā)酵產物的體外抑菌作用進行了初步研究，未來可以從發(fā)酵產物中抑菌物質的分子結構、作用位點及抑菌機制等方面進行深入研究。

3.2 榆耳發(fā)酵液多糖對小鼠免疫器官及免疫功能的影響

脾臟是人和脊椎動物體內最大的免疫器官，是免疫系統(tǒng)產生致敏淋巴細胞和抗體的重要場所。試驗結果表明，飼喂小鼠榆耳發(fā)酵液多糖的劑量為5、10 mg/d，并連續(xù)飼喂21 d，可顯著增加正常小鼠的脾臟指數(shù)。劉瑞君等研究認為，榆耳多糖可增加小鼠中樞免疫器官胸腺與脾臟指數(shù)[8]，本試驗的結果與之基本一致，但這與崔京春等的研究結果[9]不一致。榆耳發(fā)酵液多糖對小鼠免疫器官的影響程度可能與飼喂時間的長短有關。本試驗通過腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗、血清中溶血素水平測定試驗及ConA誘導淋巴細胞轉化試驗，分別評價榆耳發(fā)酵液多糖對小鼠非特異性免疫、體液免疫及細胞免疫功能[10]的影響。結果表明，榆耳發(fā)酵液多糖溶液對腹腔巨噬細胞吞噬功能和淋巴細胞轉化率的影響呈一定的量效關系，榆耳發(fā)酵液多糖中、高劑量組的作用明顯高于低劑量組，表明榆耳發(fā)酵上清液多糖對巨噬細胞吞噬功能和淋巴細胞轉化率的影響可隨濃度的升高而增強，但中、高劑量組之間無顯著性差異，表明榆耳發(fā)酵上清液多糖的最佳劑量在為5 mg/d。同時試驗結果表明，榆耳發(fā)酵上清液多糖可顯著提高小鼠外周血中血清溶血素水平，增加特異性抗體含量，繼而增強小鼠體液免疫功能，無明顯的量效關系，榆耳發(fā)酵上清液多糖的最適劑量為5 mg/d，小鼠平均體質量按20 g計算，榆耳發(fā)酵上清液多糖對小鼠免疫增強作用的有效作用劑量為 250 mg/(kg·d)。侯建明等研究發(fā)現(xiàn)，銀耳多糖的劑量在500～2 000 mg/(kg·d)范圍內可顯著提高小鼠血清溶血素水平[11]，本試驗結果與之相似。根據(jù)文獻報道，桑葉多糖等可以促進ConA誘導淋巴細胞轉化反應[12]。綜上所述，榆耳發(fā)酵上清液多糖可以提高小鼠細胞免疫功能。

本研究以榆耳G930菌種發(fā)酵上清液及發(fā)酵上清液多糖為研究對象，對榆耳發(fā)酵產物的體外抑菌及免疫增強作用進行研究。結果表明，榆耳發(fā)酵上清液具有較寬的抑菌譜和良好的耐酸性、耐熱性；榆耳發(fā)酵上清液多糖飼喂量為250 mg/(kg·d)時，可以提高小鼠的非特異性免疫功能、體液免疫功能和細胞免疫功能。表明榆耳發(fā)酵產物可作為動物疾病治療藥物及動物保健產品，發(fā)揮抗菌和增強動物機體免疫力的功效，具有廣闊的應用前景。

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