張曉曉，陳雙雙，鄭 婷，酈 楓，劉 鵬

(浙江師范大學化學與生命科學學院/浙江省野生動物生物技術與保護利用重點實驗室，浙江金華 321004)

鋁是土壤中最主要的金屬元素，通常以難溶性鋁硅酸鹽或氧化鋁等穩(wěn)定的絡合物形式存在，對植物無毒害作用，但當土壤pH值<5時，難溶性鋁會轉變?yōu)榭扇苄凿X離子，并隨著環(huán)境污染的加劇呈指數(shù)型增長。近幾年南方紅壤區(qū)土壤酸化面積加大，酸化程度日趨嚴重，造成鋁毒害現(xiàn)象加重，導致該區(qū)耕地的生產力和質量都逐步下降[1]。有研究表明，當土壤交換性鋁含量過多時，植物會表現(xiàn)出明顯的鋁毒害癥狀，主要為根尖結構被破壞以及根系的伸長和吸收功能被抑制，從而影響作物的生長和產量。

虎舌紅(ArdisiamamillataHance)屬紫金?？?Myrsinaceae)常綠小灌木，具有匍匐的木質根狀莖，葉片紅潤橢圓形，其紅紫色茸毛可折射出七彩佛光，故又稱佛光紅[2]；株形優(yōu)美，葉果皆可以觀賞，果實成熟期較長，周年不落，老果新果同掛一株，色澤紅而發(fā)亮，甚為美觀。適應性強的虎舌紅既可在各地居室中盆栽，也可在園林中作耐陰地被植物，且易栽培管理。近年來，國內外對虎舌紅的研究主要針對化學成分的種類[3]、功效[4-5]及繁殖技術[6]等方面，而對虎舌紅逆境脅迫下的探究較少，僅少數(shù)學者探索紫金?？谱辖鹋Ardisiajaponica(Thunb) Blume][7]和堇葉紫金牛(Ardisiaviolacea)[8]對干旱脅迫的生理響應，而對價值高的虎舌紅在紅壤環(huán)境下的抗鋁性研究尚未見報道。有研究顯示，一定濃度A13+處理可抑制大豆 [Glycinemax(Linn.) Merr.][9-10]根系的生長，導致其脂質過氧化[11]等；此外，較高濃度的鋁脅迫也可導致水稻(OryzasativaL.)出現(xiàn)枯萎黃化等明顯受傷癥狀[12]。因此，筆者以虎舌紅為試驗材料，通過溶液培養(yǎng)法研究鋁脅迫下其葉片活性氧的代謝情況和光合光響應特性，探討其對鋁毒害響應的生理機制，揭示其在鋁脅迫下的抗逆性大小，為紫金?？浦参锘⑸嗉t的抗鋁性和緩解土壤鋁毒害的研究提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

試驗材料為生長一致的盆栽虎舌紅(二年生扦插苗)，野生扦插苗采于江西省大余縣吉村鎮(zhèn)山區(qū)。盆栽用塑料花盆上、下口的平均直徑分別為28、15 cm，高度為20 cm，每盆定植苗木1株。1盆土壤質量約3 kg，盆底放置2層塑料紙。在光照培養(yǎng)室內土培適應1個月后，先將其轉入Hoagland’s半完全營養(yǎng)液中適應15 d，然后于完全營養(yǎng)液中進行培育和脅迫處理。試驗設計5個鋁離子(Al3+)濃度處理，分別為 0 μmol/L(CK)、200 μmol/L(T1)、500 μmol/L(T2)、1 000 μmol/L(T3)和2 000 μmol/L(T4)，各處理設3個重復。處理期間，每3 d更換1次營養(yǎng)液，在脅迫處理7、14、21 d 08：00—12：00 取頂端的第3～4張成熟葉片，測定其相關生理指標。

1.2 測定方法

采用愈創(chuàng)木酚法[13]測定葉片過氧化物酶(POD)活性，氮藍四唑(NBT)法[12]測定葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性，紫外吸收法[13]測定葉片過氧化氫酶(CAT)活性，硫代巴比妥酸法[13]測定丙二醛(MDA)含量，PAM-210葉綠素測定儀測定葉綠素熒光參數(shù)[13]，丙酮研磨法[13]測定葉綠素a、b含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

計算平均值和標準誤差。用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析，以單因素方差分析法和Duncan’s法進行顯著性差異分析，用Excel 2013、Origin 9.0軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 鋁脅迫對虎舌紅葉片SOD、POD、CAT活性的影響

2.1.1 鋁脅迫對虎舌紅葉片SOD的影響 超氧化物歧化酶(SOD)廣泛存在于生物體內，專一性地清除生物代謝過程中產生的有毒害作用的超氧陰離子自由基。從圖1可以看出，Al3+脅迫期間，隨脅迫濃度的增大，虎舌紅葉片的SOD活性先升高后降低，其中T2處理時達到最大值。低濃度T2處理組SOD活性與CK差異顯著，且脅迫14、21 d時任一處理組SOD活性均高于CK，說明在Al3+處理下虎舌紅葉片通過迅速增加SOD活性來保護細胞，在防止脅迫條件下活性氧含量增加導致的損害中起著重要作用。同時，Al3+處理7、14、21 d時，低濃度T1下SOD活性增幅分別為7.34%、17.16%、32.59%，高濃度T4下增幅分別為3.14%、9.78%、9.43%，可見低濃度對SOD活性的誘導作用強于高濃度。

在脅迫7、14、21 d時，處理組虎舌紅葉片SOD活性相比CK的最大增幅依次為37.07%、57.11%、74.43%，表明在脅迫初期，虎舌紅葉片的SOD活性被小幅度誘導，隨著脅迫時間的延長其被誘導的幅度逐漸增加，說明脅迫后期虎舌紅表現(xiàn)出了對Al3+脅迫的適應性。

2.1.2 鋁脅迫對虎舌紅葉片POD的影響 過氧化物酶(POD)是一類性質比較穩(wěn)定的氧化還原酶類，可催化由過氧化氫(H2O2)參與的各種還原劑的氧化反應，在植物對環(huán)境的應答方面起著重要的調節(jié)和保護作用。由圖1可知，除T4處理外，虎舌紅葉片的POD活性與脅迫濃度呈正相關關系，在低濃度T1處理下，POD活性保持在低水平狀態(tài)，最大增幅為54.83%；而在中濃度T3與高濃度T4處理下，處理組的POD活性與CK存在顯著差異，最小增幅為100.85%，表明較高的Al3+濃度更能激發(fā)虎舌紅葉片POD活性的上升以維持虎舌紅葉片活性氧代謝的平衡。

鋁脅迫7、14、21 d時，虎舌紅葉片的POD活性分別比對照上升了27.37%～218.71%、21.81%～239.87%、54.83%～420.48%，說明虎舌紅葉片的POD活性與脅迫時間整體上呈正相關關系，與脅迫濃度的影響情況基本一致。

2.1.3 鋁脅迫對虎舌紅葉片CAT的影響 植物代謝產物H2O2對植物細胞具有損傷作用，而過氧化氫酶(CAT)是清除H2O2的主要酶類，可保護植物細胞。目前研究已證實增強植物抗逆性的途徑之一是提高植物體內抗氧化酶類活性及增強抗氧化代謝的水平。圖1表明，在鋁脅迫條件下，處理組虎舌紅葉片CAT活性在3個處理期(7、14、21 d)均低于CK，分別為CK的33.88%～95.14%、49.91%～79.78%、59.27%～73.64%，且同一時期內隨脅迫濃度的增大其活性總體呈降低的趨勢。同時還可以看出，T1、T2、T3處理下虎舌紅葉片CAT活性的最低值均出現(xiàn)在脅迫21 d，而T4組CAT活性最低值在脅迫7 d，表明中低濃度(T1、T2、T3)處理與高濃度(T4)處理下的虎舌紅對脅迫時間的反應存在一定差異。

SOD把超氧化物歧化為H2O2后，在一定強度的環(huán)境脅迫下CAT和POD有互補的作用，脅迫期間POD活性變化趨勢與CAT相反，因此本試驗中虎舌紅葉片CAT活性的降低可能有利于POD活性的增加與其功能的發(fā)揮。

2.2 鋁脅迫對虎舌紅葉片丙二醛含量的影響

植物器官在逆境條件下，通常會發(fā)生膜脂過氧化，而MDA可反映細胞膜脂過氧化的程度以及植物對逆境條件反應的強弱。由圖2可知，鋁脅迫條件下，虎舌紅葉片內的MDA含量增加，且具有濃度效應，即隨脅迫濃度的增加，虎舌紅葉片內的MDA含量增加得越明顯，3個處理期的平均脅迫濃度從T1增加到T4時，MDA含量從對照的112.10%上升為對照的216.86%；且當濃度為T2時MDA含量開始與對照組產生明顯差異，不同時期(處理14、21 d)T2組的MDA含量分別為對照的143.44%、153.44%，反映出脅迫濃度越大，虎舌紅葉片的膜脂過氧化越嚴重。當處理時間由7 d延長到21 d時，MDA含量最大增幅由132.08%降到了95.70%，表明脅迫時間對葉片MDA含量的影響與濃度不一致。

2.3 鋁脅迫對虎舌紅葉片葉綠素熒光的影響

葉綠素熒光技術是快速檢測植物光合機構損傷程度的靈敏探針，可反映植物光合生理特性與逆境脅迫的關系。由表1可知，脅迫7、14 d時，F(xiàn)o均在T2處理時達到最大值，較對照分別增加54.83%、57.00%，而當脅迫21 d時，T3濃度時Fo被顯著抑制27.61%，這說明虎舌紅葉片在較高鋁濃度處理下光合效率會受到輕微損害。T2、T3、T4處理組的Fm在脅迫7 d時有顯著變化，而當處理14、21 d時，低鋁處理下Fm明顯增加，高鋁濃度下表現(xiàn)出被抑制。ETR為電子傳遞速率，處理7、14 d時，ETR均在T2被顯著抑制，最高被抑制了43.95%，而至脅迫21 d時各濃度處理下變化較小。 高濃度下Yield在前2個處理時間均無顯著變化，低鋁濃度對其有微小促進作用。光化學猝滅系數(shù)(qP)反映光抑制(Photosystem II)天線色數(shù)吸收的光能用于光化學反應的份額。脅迫7 d時，在T1處理下增大14.84%，而在T2處理下減小，脅迫21 d時，高濃度有顯著變化。qN為非光化學猝滅系數(shù)，在脅迫第1周期內整體上隨鋁濃度的增加呈先增大后減小再增大的趨勢，表明低鋁濃度下虎舌紅葉片可通過增加qN來緩解逆境脅迫帶來的傷害。

表1 鋁脅迫對虎舌紅葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

注：Fo表示最小熒光；Fm表示最大熒光產量；ETR表示表觀電子傳遞速率；Yield表示熒光量子效率；qP表示光化學淬滅系數(shù)；qN表示非光化學淬滅參數(shù)；同欄同列數(shù)據(jù)后的不同小寫寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 鋁脅迫對虎舌紅葉片葉綠素a、b含量的影響

葉綠素廣泛存在于綠色植物體內，具有著色和營養(yǎng)雙重功效，是植物光合色素中最重要的一類色素，而其中以葉綠素a、葉綠素b尤為重要。在鋁脅迫下，虎舌紅葉片葉綠素含量不僅直接關系著虎舌紅光合同化過程，而且是衡量其抗逆性的重要指標之一。從圖3可以看出，Al3+處理下虎舌紅葉片的葉綠素a含量、葉綠素b含量以及葉綠素a+b含量隨脅迫濃度的增加均呈先升高后下降的變化趨勢，在T2處理下達到最大值。同時，在T2處理下葉綠素a的含量在脅迫7、14、21 d 后的增幅分別為120.03%、48.81%、54.32%，葉綠素b含量的增幅分別為95.90%、50.91%、49.65%，葉綠素a+b含量的增幅分別為114.58%、49.41%、52.87%，表明低濃度且短時間的鋁脅迫有利于虎舌紅葉片葉綠素的積累。

虎舌紅葉片葉綠素b含量整體上隨著脅迫時間的延長而增加，而葉綠素a與葉綠素a+b含量整體上隨著脅迫時間的延長而下降，說明輕度脅迫能誘導虎舌紅葉片葉綠素含量的上升，且最適誘導濃度為500 μmol/L，而重度脅迫則對葉綠素含量產生抑制作用，可反映出重度脅迫下虎舌紅葉片活性氧代謝減慢。

3 討論與結論

鋁是地殼中最豐富的金屬元素，當其表現(xiàn)為細胞毒性形式時，可通過作用在根尖區(qū)而導致植物生長抑制。鋁的毒性作用機制可能是因為細胞骨架失真、胼胝質堆積對質膜表面電荷的干擾，從而引起膜的脂質過氧化[14]。本試驗結果表明，在鋁脅迫下虎舌紅會發(fā)生氧化應激、膜脂過氧化以及光合速率下降等現(xiàn)象，但抗鋁響應程度存在一定的差異。本試驗結果顯示，與CK相比，中度鋁脅迫能誘導虎舌紅SOD、POD活性上升，但高濃度鋁脅迫下僅CAT活性被抑制，這可能是由于鋁脅迫濃度超過其耐受度[15]所致。Chen等指出，金屬離子通過損害SOD等酶引起氧化脅迫[16]，符合高鋁脅迫下抗氧化酶活性被顯著抑制的現(xiàn)象；Brej報道顯示，冰草[Agropyroncristatum(L.) Gaertn.(Gramineae.)]葉片中的CAT活性在重金屬脅迫下顯著上升[17]，而本試驗說明虎舌紅CAT活性在不同脅迫濃度下均被抑制，這表明CAT可能不是其抗氧化應激反應中的關鍵酶。逆境下植物體內MDA含量會增加，含量越高表示受傷害的程度越大。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，高濃度的鋁使虎舌紅葉片MDA含量升高，說明鋁脅迫作用可導致虎舌紅葉片中活性氧等的大量產生，引發(fā)膜質過氧化，這與Ylmaz等金屬脅迫下的研究結果[18-21]一致。

光合作用是一個非常復雜的生理過程，在特定條件下所測得的光合能力可作為評估植物自身狀態(tài)的重要生理指標，而葉片的光合速率與植物的自身因素(葉綠素含量、葉片厚度等)密切相關，同時又受到光照強度、氣溫、空氣相對濕度等外界因素的限制，因此逆境鋁脅迫對光合作用的影響過程是極其復雜的。本試驗對虎舌紅葉片的葉綠素含量以及葉綠素熒光參數(shù)進行測定，從結果來看，一方面可知高鋁濃度會抑制虎舌紅的光合作用，但隨脅迫時間的延長效果減弱；而另一方面說明，前2個周期低鋁濃度(T2、T3)下虎舌紅可通過部分熒光參數(shù)Fo、Yield、qN以及葉綠素含量的增加緩解鋁毒作用，這與馬新明等輕度干旱脅迫下葉片光系統(tǒng)Ⅱ活性和光化學最大效率的增加結果[21]相一致。光合色素中的葉綠素在光合作用過程中起著接收和轉換能量的作用，能將光能轉換成化學能，其中葉綠素a分子執(zhí)行能量轉化，葉綠素b是光色素蛋白復合體的重要組成部分，其作用主要在于捕獲和傳遞光能，因此推測鋁脅迫可能通過抑制或減弱葉綠素對光能的吸收和轉化來實現(xiàn)毒害作用，而植物可通過增加葉綠素含量來抵消低鋁脅迫對自身造成的損害，卻無法抵抗高鋁脅迫帶來的傷害。

綜上所述，鋁脅迫引發(fā)的細胞內活性氧等的過度積累及其所導致的膜脂過氧化對葉綠素a、葉綠素b合成的影響可能是脅迫傷害虎舌紅幼苗的主要原因，雖然較高濃度的Al3+對虎舌紅造成某種程度的損害，但低濃度的Al3+對虎舌紅的生長沒有損傷，相反有適當?shù)拇龠M作用，因此虎舌紅具有較強的抗鋁性，并且可通過SOD活性、POD活性、葉綠素含量以及Fo、Yield、qN的增加來抵御鋁毒害，從而使自身得以生存和生長，但虎舌紅只能在一定濃度范圍內抵御鋁脅迫，因此對高濃度鋁脅迫要提前做好預防措施。

[1]吳道銘，傅友強，于智衛(wèi)，等.我國南方紅壤酸化和鋁毒現(xiàn)狀及防治[J].土壤，2013，45(4)：577-584.

[2]楊妙賢.虎舌紅野生資源的開發(fā)利用[J].中國野生植物資源，2004，23(6)：27，32.

[3]Huang J，Ogihara Y，Zhang H，et al.Triterpenoid saponins fromArdisiamamillata[J].Phytochemistry，2000，54(8)：817-822.

[4]楊海寬，江香梅，趙玲華，等.虎舌紅不同部位揮發(fā)性成分差異研究[J].江西農業(yè)大學學報，2013，35(5)：993-998.

[5]劉經亮，凌育趙，王如意，等.虎舌紅中黃酮類化學成分研究[J].中草藥，2015，46(6)：808-811.

[6]熊興隆.虎舌紅人工繁育栽培技術總結[J].農業(yè)與技術，2013(2)：120-121.

[7]張建新，葛淑芳，吳玉環(huán)，等.干旱脅迫對紫金牛葉片碳氮代謝的影響[J].水土保持學報，2015，29(2)：278-282.

[8]代英超，徐奎源，馬 凱，等.珍稀瀕危植物堇葉紫金牛對持續(xù)干旱的生理響應[J].生態(tài)學報，2015，35(9)：2954-2959.

[9]胡 蕾，應小芳，劉 鵬，等.鋁毒對大豆農藝性狀的影響[J].浙江農業(yè)科學，2004(3)：148-150.

[10]Lan T，You J F，Kong L N，et al.The interaction of salicylic acid and Ca2+alleviates aluminum toxicity in soybean (GlycinemaxL.)[J].Plant Physiology and Biochemistry，2016，98：146-154.

[11]Mendoza-Soto A B，Naya L，Leija A，et al.Responses of symbiotic nitrogen-fixing common bean to aluminum toxicity and delineation of nodule responsive microRNAs[J].Frontiers in Plant Science，2015，6：587.

[12]陳榮府，沈仁芳.水稻(OryzasativaL.)鋁毒害與耐性機制及鋁毒害的緩解作用[J].土壤，2004，36(5)：481-491.

[13]李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，2000：10-20.

[14]Arunakumara K K I U，Walpola B C，Yoon M H.Aluminum toxicity and tolerance mechanism in cereals and legumes—A review[J].Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry，2013，56(1)：1-9.

[15]Gill K K，Sandhu H S，Kaur R.Evaluation of lipid peroxidation and antioxidant status on fenvalerate，nitrate and their co-exposure inBubalusbubalis[J].Pesticide Biochemistry and Physiology，2015，123：19-23.

[16]Chen M，Zhang L L，Li J，et al.Bioaccumulation and tolerance characteristics of a submerged plant (CeratophyllumdemersumL.) exposed to toxic metal lead[J].Ecotoxicology and Environmental Safety，2015，122：313-321.

[17]Brej T.Heavy metal tolerance inAgropyronrepens(L.) P.Bauv.populations from the Legnica copper smelter area，Lower Silesia[J].Acta Societatis Botanicorum Poloniae，1998，67：325-333.

[19]Daud M K，Ali S，Variath M T，et al.Differential physiological，ultramorphological and metabolic responses of cotton cultivars under cadmium stress[J].Chemosphere，2013，93(10)：2593-2602.

[20]Hawrylak-Nowak B，Dresler S，Wójcik M.Selenium affects physiological parameters and phytochelatins accumulation in cucumber (CucumissativusL.) plants grown under cadmium exposure[J].Scientia Horticulturae，2014，172：10-18.

[21]馬新明，熊淑萍，李 琳.土壤水分對不同專用小麥后期光合特性及產量的影響[J].應用生態(tài)學報，2005，16(1)：83-87.