李 紅，李 超，張 敏

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，遼寧沈陽 110161)

金針菇[Flammulinavelutipes(Fr.)Singer.]隸屬于真菌門擔子菌亞門層菌綱無隔擔子菌亞綱傘菌目口蘑科小火焰菌屬，因形似金針菜而得名。金針菇是古今中外著名的食用菌之一，金針菇蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類豐富，具有抗癌功能，經(jīng)常食用具有預防高血壓、治療肝病和胃潰瘍等功效。金針菇特別以富含賴氨酸而著稱，可以活化神經(jīng)細胞，促進智力發(fā)育，素有“增智菇”之美稱，是當今市場上十分走俏的天然保健食品之一。隨著金針菇產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，金針菇新品種選育已成為食用菌育種研究的重要內(nèi)容之一，為此，開展金針菇菌株的遺傳多樣性分析及了解菌株間遺傳差異就具有重要意義。

隨機擴增多態(tài)性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD)標記以基因組DNA為模板，以1個隨機的寡核苷酸序列(通常為10個堿基對)作引物，通過PCR擴增反應，產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，用以檢測DNA序列的多態(tài)性。它具有程序簡單、DNA用量少、隨機引物沒有嚴格的種屬界限、不須要事先知道基因組的任何分子信息就能快速檢測大量遺傳多態(tài)性等優(yōu)點。在食用菌領(lǐng)域常用于品種鑒定、遺傳關(guān)系分析、分子遺傳的構(gòu)建及基因定位等研究。Khush等用RAPD技術(shù)分析雙孢蘑菇的野生和栽培品種，在8個異核體中識別出7個不同的基因型。說明RAPD標記在遺傳研究中的通用性和對菌株指紋識別的有效性[1]。Zhang等用RAPD標記對15個香菇菌株行分析，其中13個菌株的DNA指紋各異，2個菌株譜帶一致，說明RAPD標記可用于鑒別香菇菌種，并可用于香菇育種和菌種改良[2]。詹才新等以金針菇不同親本菌株及其雜交種為材料進行RAPD分析后，認為RAPD技術(shù)可鑒別出真?zhèn)坞s種[3]。Castle等曾以RFLP為標記進行雙孢蘑菇及大肥菇種內(nèi)和種間多態(tài)性研究。王翠等應用RAPD技術(shù)對滇西北地區(qū)冬蟲夏草、闊孢蟲草和蛹蟲草進行遺傳分化研究，表明蟲草群體中存在著顯著的地區(qū)差異性[4]。本研究應用RAPD-PCR分子標記的方法對金針菇菌株遺傳多樣性進行分析，以期為金針菇資源遺傳多樣性及遺傳育種親本的選配提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

各供試菌株的具體情況見表1。

表1 供試菌株

1.2 培養(yǎng)基

PDB綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯400 g，葡萄糖40 g，磷酸二氫鉀 6 g，硫酸鎂3 g，蛋白胨6 g，水2 000 mL，pH值自然。用于總DNA提取的菌絲培養(yǎng)。

1.3 試劑和儀器

RAPD-PCR反應所用的TaqDNA Polymerase、dNTP、10×buffer、Mg2+購自北京鼎國昌盛公司，DNA marker(DL2000)、引物購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR儀為德國Biometra公司Thermocycler。

1.4 引物

各引物的具體情況見表2。

1.5 試驗時間和地點

試驗于2017年3月在遼寧省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所進行。

表2 22個引物序列

1.6 菌絲體培養(yǎng)

將活化的菌絲切下0.5 cm2菌塊，接種于PDB綜合培養(yǎng)基，23 ℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r/min。將培養(yǎng)好的菌液用無菌水洗滌2次，用無菌濾紙汲干菌絲體表面的水分，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 總DNA提取及檢測

采用改良的CTAB法提取基因組總DNA，0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。

1.8 引物篩選

引物篩選是進行RAPD分析的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。用來篩選引物的模板采用4個具有典型性狀、親緣關(guān)系較遠的材料，這樣篩出的引物才具有代表性，RAPD-PCR擴增出的結(jié)果多態(tài)性較高且可能每份供試材料都能擴增出豐富的多態(tài)性位點。

引物參照NY/T 1743—2009《食用菌菌種真實性鑒定 RAPD法》公布的22條引物序列，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.9 PCR反應及電泳

PCR反應體系(25 μL)：模板DNA 200 ng/uL，dNTPs 200 μmol/L，引物0.4 μmol/L，TaqDNA聚合酶1.5 U，Mg2+2.5 mmol/L，10×buffer 2.5 μL，用ddH2O補至總體積25 μL。

擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，Tm退火1 min(退火溫度因不同引物而定)，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，用GelDoc-It型凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.10 數(shù)據(jù)處理

電泳結(jié)果采取0/1賦值記帶，將在瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)DNA片段的記為1，不出現(xiàn)的記為0，將統(tǒng)計形成的“0-1”數(shù)據(jù)表輸入DPSv6.55版數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件中，采用Jaccard聚類距離采用類平均法(UPGMA)進行“0-1”聚類分析，并計算遺傳相似度。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取

由圖1可以看出，每一樣品在電泳時均形成明顯的1條整齊帶，并且條帶比較亮，無彌散的熒光區(qū)出現(xiàn)，說明DNA樣品沒有降解。用CTAB法提取的DNA色澤近白色或無色。說明大多數(shù)酚類、多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)已被較徹底去除，純度比較高。

2.2 引物篩選

從22條引物中篩選出8條多態(tài)性豐富、譜帶清晰且重復性好的引物，分別為S15、S9、S6、S16、S18、S10、S4、S11，如圖2所示。

2.3 PCR反應

利用篩選出來的8條引物對35個供試菌株進行RAPD-PCR擴增，共擴增出68條條帶(圖3、圖4、圖5)，其中多態(tài)性條帶為56條，多態(tài)位點率為82%。每條引物擴增出約9條條帶，DNA片段大小為500～2 000 bp。

2.4 基于RAPD分析結(jié)果構(gòu)建樹狀圖

如圖6所示，35個菌株間的遺傳相異系數(shù)變化范圍在 0～0.71 之間。當遺傳相異系數(shù)為0.60時，供試菌株被聚類成5個類群：第1類為BJ-11、BJ-12、BJ-13、日白金、韓金、珍玉8、411、白金2、千曲、白金48、913、白金1、恒生金、白金16、高產(chǎn)2、FV80、金851、白金3、金新美15、F21、純白68、特豐6、壽光5、金1312、韓金51、白金8、白金10，全部為白色品種；第2類為黃金5032、川金3、738；第3類為金玉22；第4類為406、黃金55；第5類為金19、金43。第2、第3、第4、第5類都是黃色金針菇品種，說明RAPD分析結(jié)果與菌株農(nóng)藝性狀結(jié)果趨同。

3 結(jié)論與討論

食用菌菌種、菌株的質(zhì)量好壞直接關(guān)系到食用菌產(chǎn)業(yè)能否良性發(fā)展。目前食用菌市場缺乏統(tǒng)一管理，菌種管理混亂，菌種退化、老化，品種混雜，同種異名、同名異種等問題嚴重。分子標記技術(shù)為這一難題提供了快速、準確的鑒定手段，可以快速、靈敏、準確地用于食用菌的菌種、菌株鑒定。

選擇雜交親本是食用菌雜交育種中最為重要的一個環(huán)節(jié)之一。一直以來，育種工作者都是通過形態(tài)學分析測試來鑒定和選擇親本。這種方法耗時費力，鑒定結(jié)果也易受環(huán)境干擾。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，在分子水平上進行親本菌株的選擇勢在必行[5]。

本研究應用RAPD-PCR分子標記的方法對金針菇菌株遺傳多樣性進行分析，從22條引物中篩選出8條多態(tài)性豐富、譜帶清晰且重復性好的引物進行RAPD-PCR擴增。結(jié)果顯示，8條引物均能將供試菌株區(qū)分開，表明RAPD分子標記對金針菇菌株遺傳多樣性分析是可行的，并能把白色金針菇和黃色金針菇區(qū)分開來，與菌株農(nóng)藝性狀結(jié)果趨同。

但是，RAPD-PCR分子標記技術(shù)也有缺點，即穩(wěn)定性和重復性不好，為了克服這些缺點，下一步的工作將開發(fā)由RAPD標記轉(zhuǎn)化的特定序列擴增(SCAR，sequence characterized amplified region)標記，相對于RAPD標記[6]，SCAR標記所用引物較長且引物序列與模板DNA完全互補，可在嚴謹條件下進行擴增，因此結(jié)果穩(wěn)定性好、可重復性強[7-8]，用SCAR標記分析金針菇種質(zhì)資源更可靠。

[1]Khush R S，Becker E，Wach M.DNA amplification polymorphisms of the cultivated mushroomAgaricusbisporus[J].Applied and Environmental Microbiology，1992，58(9)：2971-2977.

[2]Zhang Y，Moilina F L.Strain typing oflentinulaedodesby random amplified polymorphic DNA assay[J].FEMS Microbiology Letters，1995，131(1)：17-20.

[3]詹才新，朱蘭寶.RAPD技術(shù)在金針菇雜交育種中的應用[J].食用菌學報，1995，2(1)：7-11.

[4]王 翠，謝寶貴，陳梁軍，等.金針菇菌株的SCAR標記分子鑒別[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2013，28(10)：966-970.

[5]李 博.金針菇遺傳連鎖圖的構(gòu)建及菌絲生長速度的QTL定位[D].福州：福建農(nóng)林大學，2009：30-37.

[6]龐瑞華，王 玲，李小寧，等.信陽地區(qū)水稻資源的遺傳多樣性分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2016，44(7)：113-116.

[7]傅 冰.SCAR標記在地木耳菌株分類鑒定中的運用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2016，44(9)：64-66，74.

[8]劉靖宇，宋秀高，葉 夏，等.香菇菌株遺傳多樣性ISSR，RAPD和SRAP綜合分析[J].食用菌學報，2011，18(3)：1-8.