韋坤華，徐建平，蔡錦源，李林軒，繆劍華，高文遠

(1.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；2.廣西藥用植物園/廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室，廣西南寧 530023；3.廣西科技大學(xué)鹿山學(xué)院，廣西柳州 545616；4.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

白花蛇舌草(HedyoticdiffusaWilld.)為茜草科耳草屬一年生草本植物。全草入藥，味苦、甘，性寒。具有清熱解毒、利濕之功效，用于治療肺熱喘嗽、毒蛇咬傷、咽喉腫痛等疾病[1]。白花蛇舌草廣泛分布于亞熱帶地區(qū)，主產(chǎn)于我國福建、廣東、江西、浙江、湖南等地，云南、貴州及四川南部亦有大量分布[2]?；瘜W(xué)研究表明，白花蛇舌草中主要含有萜類、蒽醌類、黃酮類、揮發(fā)油類、苯丙素和香豆素類、甾醇類、含酸化合物、多糖類化合物，其中萜類為白花蛇舌草的主要成分[3-4]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫、神經(jīng)保護等多種藥理作用[5-10]，具有重要的開發(fā)應(yīng)用價值。

近年來，由于使用量增加，白花蛇舌草資源不斷枯竭，產(chǎn)量難以滿足市場需求。且在人工栽培種植過程中發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草極易混入傘房花耳草等偽品植株，造成藥材品質(zhì)下降。為了解決白花蛇舌草種源純化問題，筆者在前人研究[11-12]的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計，優(yōu)化白花蛇舌草組織培養(yǎng)快速繁殖體系。同時，在研究過程中，發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草不同部位在離體條件下較為容易再生獲得植株，因此，本研究也采用正交試驗設(shè)計對白花蛇舌草不同外植體的植株再生及培養(yǎng)體系進行篩選、優(yōu)化，建立了不同外植體的快速繁殖培養(yǎng)體系，為其離體快繁技術(shù)的建立提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料采自廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，為野生白花蛇舌草的種子，種子播種于MS基本培養(yǎng)基，發(fā)芽后獲得無菌苗，再選取無菌苗的不同部位進行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，最后對叢生芽進行生根培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子消毒 取白花蛇舌草的成熟未開裂果實，依次用2%(體積分?jǐn)?shù))洗潔精水溶液浸泡5 min，線狀自來水沖洗15～30 min，用75%的乙醇滅菌15 s，無菌水沖洗1遍，再置于添加了2～3滴吐溫-20的0.1%(體積分?jǐn)?shù))氯化汞溶液中消毒9 min，無菌水沖洗3～5次，每次浸洗2 min，無菌濾紙吸干外植體表面的水分后，在無菌操作臺上將果實撥開，將種子接種于MS空白培養(yǎng)基上培養(yǎng)促進種子萌發(fā)。培養(yǎng)條件為光照度1 500～2 000 lx，光照時間12 h/d，溫度(26±2)℃。

1.2.2 試驗培養(yǎng)基設(shè)計 試驗采用正交試驗進行，以MS為基本培養(yǎng)基，應(yīng)用正交表L9(34)，對6-BA、KT和IAA等3個因素的3個水平設(shè)計正交試驗培養(yǎng)基。正交試驗的激素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.2.3 不同外植體的處理 將種子萌發(fā)后的嫩芽接種到添加0.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照度1 500～2 000 lx，光照時間12 h/d，溫度(26±2)℃。獲得足夠數(shù)量的叢生芽后，分別選取叢生芽的3個不同部位(帶芽莖段、幼嫩葉片、不帶芽莖段)作為外植體進行正交試驗。

帶芽莖段：切下1 cm的頂芽或帶1個腋芽的莖段，插入到培養(yǎng)基上培養(yǎng)，插入深度0.3～0.4 cm；幼嫩葉片：切取長約0.5 cm、寬度基本一致的幼嫩葉片，在葉片上用解剖刀輕輕劃2道傷口后，平鋪到培養(yǎng)基表面培養(yǎng)；不帶芽莖段的處理：選取幼嫩莖段，切取長度約0.5 cm的節(jié)間部分，平鋪到培養(yǎng)基表面培養(yǎng)。

1.2.4 材料培養(yǎng)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計 每個試驗處理4瓶，每瓶接種5個外植體，培養(yǎng)條件為光照度1 500～2 000 lx，光照時間 12 h/d，溫度(26±2)℃，培養(yǎng)室中培養(yǎng)30 d后測定試管苗平均生長率和芽增殖系數(shù)。其中平均生長率=(30 d后材料質(zhì)量-接種時材料質(zhì)量)/接種時材料質(zhì)量；平均芽增殖系數(shù)=(30 d后芽數(shù)-接種時材料數(shù))/接種時材料數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素對白花蛇舌草帶芽莖段培養(yǎng)的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草的外植體在無菌組培條件下較容易獲得叢生芽。為了明確不同激素組合對白花蛇舌草的帶芽莖段增殖的影響，本研究將1 cm的頂芽或帶1個腋芽的莖段，接種到正交試驗培養(yǎng)基中，每天觀察記錄接種材料的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)5 d開始，接觸培養(yǎng)基的切口部位開始膨大形成疏松愈傷組織，之后逐漸形成胚性愈傷，到11～13 d可明顯觀察到接觸培養(yǎng)基的切口部位形成叢生芽團，并長出少量成型叢生芽(圖1)。但不接觸培養(yǎng)基部分的腋芽或頂芽伸長，未見分化形成叢生芽。

對帶芽莖段培養(yǎng)的正交試驗結(jié)果見表2至表4。平均生長率結(jié)果來看，白花蛇舌草帶芽莖段培養(yǎng)30 d后，平均生長率在4.7～7.6倍之間。直觀分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種外源激素對帶芽莖段培養(yǎng)的平均生長率影響順序為A(6-BA)>C(KT)>B(IAA)，且3種激素均表現(xiàn)出低濃度促進生長，但濃度過高均抑制平均生長率的進一步增高。方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種激素對白花蛇舌草帶芽莖段的平均生長率均具有顯著影響，F(xiàn)值分別為44.33、36.33和25.58。根據(jù)平均生長率的分析結(jié)果，確定帶芽莖段增殖的最佳培養(yǎng)基外源激素配方為A2B2C2，即MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L KT。

由芽的平均增殖系數(shù)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草帶芽莖段培養(yǎng)的平均芽增殖系數(shù)均在23倍以上。直觀分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種外源激素對葉片培養(yǎng)芽增殖系數(shù)影響順序為A(6-BA)>C(KT)>B(IAA)，其中6-BA濃度的提高有利于促進帶芽莖段培養(yǎng)材料叢生芽的增殖，而適度增加IAA和KT濃度可促進叢生芽的增殖，但濃度過高具有抑制作用。方差分析結(jié)果表明，3種激素均對帶芽莖段培養(yǎng)材料均無顯著影響，P值均>0.1。但不同培養(yǎng)基上的芽增殖系數(shù)差異較大，最低的芽增殖系數(shù)為23.2倍，而最高的芽增殖系數(shù)為46.2倍。根據(jù)平均芽增殖系數(shù)的分析結(jié)果，確定帶芽莖段增殖的最佳培養(yǎng)基外源激素配方為A3B2C2，即MS+2.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L KT。

表2 白花蛇舌草莖段培養(yǎng)正交試驗結(jié)果與直觀分析

表3 白花蛇舌草帶芽莖段培養(yǎng)平均生長率方差分析

表4 白花蛇舌草帶芽莖段培養(yǎng)芽增殖系數(shù)方差分析

根據(jù)上述分析結(jié)果，3種外源激素對帶芽莖段培養(yǎng)材料的平均生長率具有顯著影響，對芽增殖系數(shù)沒有顯著影響，較高濃度下，芽的增殖系數(shù)也較高。在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，帶芽莖段培養(yǎng)的材料中，接種的母芽很少分化形成叢生芽，僅為頂芽抽長或長出少量腋芽，而且培養(yǎng)材料容易出現(xiàn)葉片黃化、老化的現(xiàn)象。而接觸培養(yǎng)基的切口部位長出的新的叢生芽由于生長空間限制，長勢不一致，不利于實際生產(chǎn)利用。因此根據(jù)結(jié)果分析與材料的實際生長狀況，確定嫩芽或腋芽增殖的最佳培養(yǎng)基外源激素配比為A2B2C2，即MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L KT。

2.2 外源激素對白花蛇舌草葉片培養(yǎng)的影響

在進行帶芽莖段培養(yǎng)的過程中，發(fā)現(xiàn)接觸培養(yǎng)基的幼嫩葉片出現(xiàn)膨大，并形成叢生芽的現(xiàn)象。為了驗證這一現(xiàn)象，并探討不同外源激素組合對白花蛇舌草葉片培養(yǎng)的影響，本研究將白花蛇舌草的無菌幼嫩葉片外植體接入不同激素不同水平的MS培養(yǎng)基，觀察記錄其生長發(fā)育情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草葉片培養(yǎng)的成芽率為100%，所有培養(yǎng)葉片均膨大形成疏松愈傷組織，再形成胚性愈傷，繼而形成叢生芽簇。幼嫩葉片在培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～6 d開始從切口部位出現(xiàn)不同程度的蜷曲膨脹，6 d開始在膨大部位長出翠綠色成簇的不定芽點，10 d時不定芽分化更為明顯，高約0.5 cm，呈翠綠色，且向無切口部位擴大，之后逐漸形成叢生芽簇(圖2)。

30 d后統(tǒng)計葉片外植體的平均生長率與芽增殖系數(shù)，結(jié)果見表5見表7。根據(jù)平均生長率結(jié)果，白花蛇舌草葉片外植體培養(yǎng)30 d后，最低的平均生長率為4.1倍，最高的平均生長率為8.1倍。平均生長率的直觀分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種外源激素對葉片培養(yǎng)平均生長率的影響順序為B(IAA)>C(KT)>A(6-BA)，其中6-BA濃度增加，抑制平均生長率的提高，IAA濃度的增加可促進平均生長率的提高，而適度增加KT濃度可提高平均生長率，但濃度過高具有抑制作用。方差分析發(fā)現(xiàn)3種激素均對葉片的增殖具有影響，F(xiàn)值分別為10.11、43.00和21.44。根據(jù)平均生長率的分析結(jié)果，確定葉片增殖的最佳培養(yǎng)基外源激素配方為A1B3C2，即MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA+0.3 mg/L KT。

根據(jù)芽的平均增殖系數(shù)結(jié)果，白花蛇舌草葉片外植體培養(yǎng)的平均芽增殖系數(shù)均在25倍以上。直觀分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種外源激素對葉片培養(yǎng)芽增殖系數(shù)影響順序為A(6-BA)>C(KT)>B(IAA)，其中6-BA和IAA濃度的提高有利于葉片培養(yǎng)材料叢生芽的增殖，而適度增加KT濃度可促進葉片培養(yǎng)材料叢生芽的增殖，但濃度過高具有抑制作用。方差分析發(fā)現(xiàn)，3種激素均對葉片培養(yǎng)無顯著影響，P值均>0.1。但不同培養(yǎng)基上的芽增殖系數(shù)差異較大，最低的芽增殖系數(shù)為25.3倍，而最高的芽增殖系數(shù)為54.5倍。根據(jù)平均芽增殖系數(shù)的分析結(jié)果，確定葉片增殖的最佳培養(yǎng)基外源激素配方為A3B3C2，即MS+2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA+0.3 mg/L KT。

上述分析結(jié)果表明，3種外源激素對葉片培養(yǎng)的平均生長率具有顯著影響，對芽增殖系數(shù)沒有顯著影響，且芽的增殖系數(shù)隨著激素濃度的增加而增加。但在本試驗過程中發(fā)現(xiàn)，葉片培養(yǎng)材料的芽增殖系數(shù)增加到一定程度后，由于生長空間不足，容易造成叢生芽纖細、黃化等現(xiàn)象，培養(yǎng)時間稍微延長容易出現(xiàn)枯死，不利于種苗的工廠化生產(chǎn)。因此根據(jù)結(jié)果分析與材料的實際生長狀況，確定葉片增殖的最佳培養(yǎng)基外源激素配比為A1B3C2，即MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA+0.3 mg/L KT。在此培養(yǎng)條件下，平均生長率約為7.5倍，芽增殖系數(shù)約為40倍，材料生長狀況良好，叢生芽粗壯，色澤翠綠。

表5 白花蛇舌草葉片培養(yǎng)正交實驗結(jié)果與直觀分析

表6 白花蛇舌草葉片培養(yǎng)平均生長率方差分析

表7 白花蛇舌草葉片培養(yǎng)芽增殖系數(shù)方差分析

2.3 外源激素對白花蛇舌草莖段(不帶腋芽)培養(yǎng)的影響

為了拓展外植體來源，為其他材料的組織培養(yǎng)，尤其是珍稀瀕危物種的組織培養(yǎng)提供技術(shù)依據(jù)，本研究還考察了不同激素組合對白花蛇舌草節(jié)間不帶芽莖段培養(yǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草不帶芽的莖段培養(yǎng)成芽率為100%，所有培養(yǎng)莖段均從兩端切口處膨大形成疏松愈傷組織后形成胚性愈傷，繼而形成叢生芽簇。根據(jù)試驗記錄，莖段在培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4 d開始從切口部位出現(xiàn)不同程度的膨大，10～12 d觀察到莖段兩端長出大量叢生芽(圖3)。

30 d后統(tǒng)計莖段外植體的平均生長率與芽增殖系數(shù)，結(jié)果見表8至表10。根據(jù)平均生長率結(jié)果，白花蛇舌草莖段外植體培養(yǎng)30 d后，最低的平均生長率為4.6倍，最高的平均生長率為9.4倍。從平均生長率的直觀分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種外源激素對葉片培養(yǎng)芽增殖系數(shù)影響順序為A(6-BA)> B(IAA)> C(KT)，其中6-BA濃度的提高可顯著提高莖段培養(yǎng)材料的平均生長率，范圍值R為3.77，而IAA與KT濃度的提高對莖段培養(yǎng)平均生長率的影響不大，范圍值R分別為0.80和0.27。方差分析發(fā)現(xiàn)6-BA對莖段培養(yǎng)的平均生長率具有顯著影響，而IAA和KT無顯著影響。根據(jù)平均生長率的分析結(jié)果，確定莖段增殖的最佳培養(yǎng)基外源激素配方為A3B2C2，即MS+2.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L KT。

表8 白花蛇舌草不帶芽莖段培養(yǎng)正交實驗結(jié)果與直觀分析

表9 白花蛇舌草不帶芽莖段培養(yǎng)平均生長率方差分析

表10 白花蛇舌草不帶芽莖段培養(yǎng)芽增殖系數(shù)方差分析

根據(jù)芽的平均增殖系數(shù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草莖段外植體培養(yǎng)的平均芽增殖系數(shù)均在23.9倍以上。直觀分析發(fā)現(xiàn)，3種外源激素對葉片培養(yǎng)芽增殖系數(shù)影響順序為A(6-BA)>C(KT)>B(IAA)，其中6-BA濃度的提高可顯著提高莖段培養(yǎng)材料的芽增殖系數(shù)，范圍值R為9.53；適度的IAA濃度可提高莖段材料的芽增殖系數(shù)，但濃度過高具有抑制作用；KT濃度的增加對莖段培養(yǎng)材料的影響不具有規(guī)律性，試驗中表現(xiàn)為較低與較高濃度均能提高培養(yǎng)材料的芽增殖系數(shù)。方差分析發(fā)現(xiàn)3種激素對葉片培養(yǎng)均無顯著影響，P值均>0.1。但不同培養(yǎng)基上的芽增殖系數(shù)差異較大，最低的芽增殖系數(shù)為23.9倍，而最高的芽增殖系數(shù)為45.0倍。根據(jù)平均芽增殖系數(shù)的分析結(jié)果，確定葉片增殖的最佳培養(yǎng)基外源激素配方為A3B2C3，即MS+2.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.5 mg/L KT。

上述分析結(jié)果表明，6-BA對莖段培養(yǎng)的平均生長率具有顯著影響，對芽增殖系數(shù)沒有顯著影響，IAA與KT對莖段培養(yǎng)的平均生長率和芽增殖系數(shù)均無顯著影響，但較高濃度的激素組合獲得較高的芽增殖系數(shù)。在試驗過程中觀察發(fā)現(xiàn)，莖段培養(yǎng)獲得的叢生芽長勢較為均一，色澤翠綠，植株健壯，是比較理想的工廠化生產(chǎn)材料。因此根據(jù)結(jié)果分析與材料的實際生長狀況，確定莖段培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基外源激素配比為A3B2C2，即MS+2.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L KT。在此培養(yǎng)條件下，平均生長率約為9.0倍，芽增殖系數(shù)約為40倍，材料生長狀況良好，叢生芽粗壯，色澤翠綠。

3 討論

在體外培養(yǎng)條件下，白花蛇舌草的芽、幼嫩葉片與不帶芽莖段均適用于叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，均可培養(yǎng)獲得大量叢生芽，且成芽率均達100%。但不同來源的外植體培養(yǎng)效果并不相同，幾乎所有叢生芽均是通過接觸培養(yǎng)基的切口部位萌動形成愈傷組織后再生形成叢生芽。嫩芽或帶腋芽嫩莖培養(yǎng)的材料，不接觸培養(yǎng)基部分往上延伸，但不分化形成叢生芽，頂部材料容易枯黃，而基部材料由于空間限制，叢生芽長勢不均一，難以獲得優(yōu)質(zhì)材料。以幼嫩葉片或不帶芽嫩莖為外植體培養(yǎng)的材料，獲得的叢生芽長勢較為均一，顏色翠綠新鮮，成苗質(zhì)量較好，但需要控制叢生芽增殖系數(shù)，以免增殖系數(shù)過高，獲得的叢生芽缺少生存空間而出現(xiàn)黃化等現(xiàn)象。

不同的激素組合對白花蛇舌草外植體培養(yǎng)的影響不同，嫩芽或腋芽培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基激素配比為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L KT；以幼嫩葉片為外植體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基激素配比為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA+0.3 mg/L KT；以莖段為外植體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基激素配比為MS+2.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L KT。但綜合考慮整體試驗結(jié)果，3種材料的最適 6-BA 濃度均不相同，表明對3種不同外植體培養(yǎng)產(chǎn)生的不同影響主要來源為6-BA。

數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草不同外植體培養(yǎng)材料的平均生長率與芽增殖系數(shù)之間并不存在線性關(guān)系，平均增長率高的試驗組，芽增殖系數(shù)并不一定高，反之亦然。因此，在進行最佳培養(yǎng)條件確定時，需要綜合材料的培養(yǎng)狀況，選擇適宜生產(chǎn)最優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)材料的培養(yǎng)方案。

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