費(fèi)新茹，朱 娟，郭 紅，呂 超，郭寶健，許如根

(1.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省作物遺傳生理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/揚(yáng)州大學(xué)大麥研究所，江蘇揚(yáng)州 225009； 2.鹽都區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇鹽城 224011)

大麥黃花葉病是東亞和歐洲等冬大麥區(qū)的主要病毒病害之一，由大麥黃花葉病毒(Barley yellow mosaic virus，BaYMV)和大麥溫和花葉病毒(Barley mild mosaic virus，BaMMV)引起，攜帶病毒的禾谷多黏菌(Polymyxagraminis)可在土壤中存活10年以上[1]。化學(xué)方法很難防治大麥黃花葉病，發(fā)掘抗性種質(zhì)、培育和利用抗病品種是防控該病害最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。關(guān)于大麥黃花葉病抗性遺傳和基因定位的研究已有不少的報(bào)道。已定位分布于大麥7條染色體上的大麥黃花葉病抗性基因有18個(gè)， Rym14Hb、 Rym16Hb及 Rym17為顯性基因，其余的均為隱性基因。不同來源的抗病基因?qū)Σ煌《局晗档目剐圆煌缰袊胤狡贩N木石港3號(hào)的兩個(gè)抗性基因 Rym1和 Rym5，位于4HL上的 Rym1對(duì)歐洲現(xiàn)存的所有病毒株系均表現(xiàn)為完全抗性，對(duì)日本的毒株BaYMV-I、BaYMV-II、BaMMV-Kal和BaMMV-Nal表現(xiàn)為完全抗性，對(duì)日本另一毒株BaYMV-III表現(xiàn)為中抗[2]。位于3HL上的 Rym5對(duì)日本毒株BaYMV-I、BaYMV-II、BaYMV-IV、BaYMV-V以及BaMMV-Kal具有抗性，對(duì)BaYMV-III以及歐洲毒株BaMMV-SIL和BaMMV-Teik表現(xiàn)感病[3-4]。隨著大麥黃花葉病病毒毒株的分化與變異，新類型毒株可能導(dǎo)致抗性品種抗性的下降或喪失。為確保大麥生產(chǎn)上應(yīng)用品種對(duì)大麥黃花葉病的抗性，必須不斷發(fā)掘新的大麥黃花葉病抗性基因并在育種中加以利用。

本研究以1個(gè)大麥黃花葉病抗感DH群體及其親本為材料，對(duì)其大麥黃花葉病抗性基因進(jìn)行遺傳分析與QTL定位，分析揚(yáng)飼麥1號(hào)大麥黃花葉病抗性基因的位置、效應(yīng)及穩(wěn)定性，以期發(fā)掘新的抗性基因，為大麥黃花葉病抗性基因的精細(xì)定位及分子標(biāo)記輔助選擇育種提供有利信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究利用一套包含173個(gè)DH系的DH群體及其親本對(duì)大麥黃花葉病的抗性位點(diǎn)進(jìn)行QTL定位。該DH群體是以揚(yáng)飼麥1號(hào)×Gairdner的F1經(jīng)花藥培養(yǎng)及染色體加倍技術(shù)構(gòu)成的加倍單倍體，其母本揚(yáng)飼麥1號(hào)是由揚(yáng)州大學(xué)選育的抗大麥黃花葉病的六棱飼料大麥品種，父本Gairdner是由澳大利亞選育的感大麥黃花葉病的二棱啤酒大麥品種。該群體由澳大利亞塔斯馬尼亞大學(xué)周美學(xué)教授提供。

1.2 田間種植

2014年和2015年秋季將試驗(yàn)材料播種于揚(yáng)州大學(xué)大麥黃花葉病病圃。每份材料人工點(diǎn)播兩行，行長1.2 m，行距0.2 m，每行點(diǎn)播40粒，三次重復(fù)。田間管理同大田栽培管理方法。

1.3 抗性鑒定

大麥黃花葉病病級(jí)調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照黃培忠等的方法[5]，稍作修改。大麥黃花葉病發(fā)病始期開始調(diào)查，每隔7 d調(diào)查1次，連續(xù)調(diào)查3期。每個(gè)株系連續(xù)調(diào)查10株，根據(jù)葉片病斑的有無及葉片黃化、萎縮程度，將大麥黃花葉病抗性分為以下4級(jí)：

1級(jí)：沒有病斑，葉片呈正常綠色(圖1A)；

2級(jí)：葉色基本正常，葉脈周邊出現(xiàn)不連續(xù)的黃花斑點(diǎn)(圖1B)；

3級(jí)：葉片黃化，黃花斑點(diǎn)連成線，但植株未矮化(圖1C)；

4級(jí)：葉片黃花斑點(diǎn)連成片，植株出現(xiàn)矮化或枯萎死亡現(xiàn)象(圖1D)。

圖1 大麥黃花葉病抗性級(jí)別

病情評(píng)價(jià)指標(biāo)采用病情指數(shù)(Disease index，DI)來表示，病情指數(shù)公式：

DI=∑nx/4N×100

x代表每個(gè)調(diào)查植株的抗性級(jí)別(即1、2、3、4級(jí))，n代表各病級(jí)的植株數(shù)量，N代表所調(diào)查的總植株數(shù)。

1.4 親本及DH群體的抗性差異分析

使用 EXCEL 2016對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)雙親及DH群體進(jìn)行抗性差異的統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 DH群體遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

篩選親本間多態(tài)性好的SSR標(biāo)記，利用這些多態(tài)性標(biāo)記對(duì)親本及173個(gè)DH系進(jìn)行基因型鑒定，與揚(yáng)飼麥1號(hào)相同的帶型記為0，與Gairdner相同的帶型記為2，雜合或缺失記為1，利用JoinMap 4.0[6]軟件構(gòu)建DH群體的遺傳連鎖圖譜。

1.6 QTL定位

利用兩年共六個(gè)時(shí)期的數(shù)據(jù)，采用Windows QTL IciMapping 4.0[7]軟件中的完備區(qū)間-加性模型(ICIM-ADD)定位方法，掃描步長為1 cM，以LOD值2.5作為閾值[8]，QTL的命名遵循McCouch[9]的原則。

2 結(jié)果與分析

2.1 DH群體的遺傳連鎖圖譜

對(duì)揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院大麥研究所保存的1 008對(duì)SSR標(biāo)記在親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，獲得91對(duì)多態(tài)性好的SSR標(biāo)記。利用這些多態(tài)性標(biāo)記對(duì)親本及173個(gè)DH系進(jìn)行基因型鑒定(圖2)，利用JoinMap 4.0軟件構(gòu)建DH群體的遺傳連鎖圖譜(圖3)，該圖譜覆蓋大麥全基因組1 161.99 cM， 91對(duì)SSR標(biāo)記分布于大麥7條染色體上，標(biāo)記間平均遺傳距離為12.77 cM，平均每條染色體上的標(biāo)記個(gè)數(shù)為13個(gè)。

P1：親本揚(yáng)飼麥1號(hào)；P2：親本Gairdner；1～49：部分DH系。

P1:Yangsimai 1; P2:Gairdner; 1-49:Part of the DH lines.

圖2引物Bmag0838對(duì)部分DH系的擴(kuò)增條帶

Fig.2AmplificationbandsofSSRmarkerBmag0838inDHpopulation

2.2 DH群體及其親本的大麥黃花葉病病情指數(shù)

由表1可知，親本及DH群體大麥黃花葉病病情指數(shù)平均值均以2016年略高，兩年均以第二調(diào)查期病情指數(shù)最高。兩年6個(gè)調(diào)查時(shí)期大麥黃花葉病病情指數(shù)在親本間均存在極顯著差異。從DH群體變異系數(shù)和變幅來看，黃花葉病病情指數(shù)在DH群體內(nèi)存在廣泛的變異，DH群體2015年三期黃花葉病病情指數(shù)離散程度均大于2016年同期離散程度，2015年第一期及2016年第三期DH群體大麥黃花葉病病情指數(shù)存在不同程度的超高親或超低親遺傳現(xiàn)象。

由表2可知，黃花葉病病情指數(shù)在年份間、調(diào)查時(shí)期間、DH系間及基因型與調(diào)查時(shí)期互作間、基因型與年份互作間的差異均達(dá)到極顯著水平，說明黃花葉病病情指數(shù)在DH群體各系間存在豐富的遺傳變異，同時(shí)，年份間的氣候條件及調(diào)查時(shí)期對(duì)黃花葉病病情指數(shù)有一定影響。

圖3 大麥 DH 群體遺傳連鎖圖譜

年份Year時(shí)期Stage親本Parent揚(yáng)飼麥1號(hào)Yangsimai1Gairdnert值tvalueDH群體DHpopulation均值Mean變幅Range變異系數(shù)CV/%2014-2015第一期StageⅠ25.0066.6729.00**41.2125.00～72.5030.55第二期StageⅡ25.0075.8323.06**41.3725.00～73.3331.19第三期StageⅢ25.0072.5016.46**38.0225.00～66.6730.292015-2016第一期StageⅠ25.0075.8361.00**50.7225.00～73.3326.93第二期StageⅡ26.6776.6721.22**62.6128.33～75.0019.70第三期StageⅢ25.8375.0059.00**52.8925.00～75.0028.68

*表示親本在0.05水平差異顯著；**表示親本在0.01水平差異顯著。下同。

* and ** mean significantly different between parents at 0.05 and 0.01 levels,respectively.The same in table 2.

表2 不同調(diào)查時(shí)期DH群體病情指數(shù)的方差分析Table 2 ANOVA of DI in DH population at different survey stages

2.3 大麥黃花葉病抗性的QTL定位結(jié)果

采用Windows QTL IciMapping完備復(fù)合區(qū)間作圖法，以大麥黃花葉病病情指數(shù)為指標(biāo)，進(jìn)行大麥黃花葉病抗性QTL定位，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，兩年6個(gè)調(diào)查時(shí)期共檢測到9個(gè)與大麥黃花葉病抗性相關(guān)的QTLs，分布于1H、2H、4H、5H和7H上。位于1H上的 qRYM-1Ha在2015年第一期及2016年3個(gè)時(shí)期均被檢測到，位于MGB402～Bmac0213標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋3.19%～38.98%的表型變異； qRYM-1Hb僅在2015年第一期和第二期被檢測到，位于GBM1411～Bmag0579標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋的表型變異分別為10.39%和5.61%； qRYM-1Hc 除在2015年第一時(shí)期未被檢測到外，在其余5個(gè)時(shí)期均被檢測到，位于Bmag0345～GBM1411標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋3.17%～21.46%的表型變異。位于2H上的 qRYM-2Ha在兩年間六個(gè)時(shí)期均被檢測到，位于EBmag0793～GBM1047標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋的表型變異為5.61%～38.04%； qRYM-2Hb在 2015年第二、三期和2016年第一期被檢測到，位于GBM1047～Bmag0749標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋的表型變異為11.40%～18.80%。位于4H上的 qRYM-4Ha在2015年第三期和2016年第一期被檢測到，位于MGB396～ HVMLOH1B標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋的表型變異為3.21%～6.53%。位于5H上的 qRYM-5Ha，僅在2015年第一、二期被檢測到，位于Bmag0812～GBM1438標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋的表型變異在5%以下。位于7H上的 qRYM-7Ha僅在2015年間第三期被檢測到，位于EBmag0827～Bmag0110標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋的表型變異為4.21%； qRYM-7Hb僅在2016年第一、三期被檢測到，位于Bmag0206～Bmag0915標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋的表型變異分別為4.18%和3.07%。從抗性QTLs的加性效應(yīng)來看，除 qRYM-4Ha抗性QTLs來自感病親本Gairdner外，其余所有抗性QTLs均來自于抗病親本揚(yáng)飼麥1號(hào)。

表3 大麥黃花葉病抗性QTLs在染色體上的位置及效應(yīng)分析Table 3 Chromosome positions and effects analysis of resistance QTLs to barley yellow mosaic disease

3 討 論

大麥黃花葉病主要通過病土、病根殘?bào)w和病田流水并以土壤中的禾谷多黏菌為媒介進(jìn)行傳播，其發(fā)病嚴(yán)重度與大麥品種的抗病能力、大田土壤中病毒株系的種類與數(shù)量、氣溫以及土壤濕度等因素有關(guān)。大麥黃花葉病通過接種鑒定比較困難，成功率低，通常在黃花葉病病圃田中自然誘發(fā)。因此，環(huán)境對(duì)大麥黃花葉病鑒定的影響較大。土壤溫度在10～16℃時(shí)最適宜病情發(fā)展，當(dāng)溫度高于20℃病害癥狀會(huì)有所減輕、逐漸隱癥。多雨高濕環(huán)境適于禾谷多黏菌休眠孢子的萌發(fā)和游動(dòng)孢子的侵染，有利于病害的發(fā)生。本研究中，2015年與2016年間黃花葉病病情指數(shù)的差異顯著，且2016年各期黃花葉病病情指數(shù)均高于2015年黃花葉病病情指數(shù)，這可能是因?yàn)?015-2016年揚(yáng)州大麥越冬期氣溫較高、雨水勻和，有利于禾谷多黏菌的游動(dòng)與侵染傳毒，從而導(dǎo)致返青后大麥黃花葉病發(fā)病較重。

大麥黃花葉病一般表現(xiàn)為多基因控制的數(shù)量性狀，同時(shí)受環(huán)境及基因與環(huán)境互作的影響[10-11]。本研究兩年共檢測到9個(gè)抗大麥黃花葉病QTLs，其中，兩年共同檢測到的QTLs有5個(gè)，說明大麥黃花葉病的確是受多基因控制的性狀，受到年份間環(huán)境及QTLs與環(huán)境互作效應(yīng)的影響。

目前，已經(jīng)有部分大麥黃花葉病抗性QTLs被定位，若干抗性基因被克隆且部分已應(yīng)用于大麥品種改良中[2,3,4,12-26]。與已有關(guān)于大麥黃花葉病抗性基因定位的研究進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)本研究檢測到的部分QTLs可能與已報(bào)道的基因是等位基因或是同一基因。如 qRYM-1Hc的位置與Yang等[27]利用抗病品種HHOR3365與感病品種Igri構(gòu)建的DH群體定位到的位于標(biāo)記k04311-1與k04452之間的 rym7相近，可能是 rym7的等位基因。 qRYM-2Ha和 qRYM-2Hb的位置與Ruge-Wehling等[24]從球莖大麥中定位到大麥黃花葉病抗性基因 Rym16Hb的位置相近，可能是 Rym16Hb的等位基因。位于1H上 qRYM-1Ha和位于4H上 qRYM-4Ha所在區(qū)域至今沒有相關(guān)的QTL位點(diǎn)報(bào)道，很可能是新的抗大麥黃花葉病QTL位點(diǎn)，但該結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證，今后將構(gòu)建次級(jí)作圖群體，從而對(duì)大麥黃花葉病抗性QTLs進(jìn)行精細(xì)定位。

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